146379. lajstromszámú szabadalom • Bioszintetikus eljárás etiokobalamin-karbonsavak B12 vitaminná való átalakítására
2 146.379 kobalamin karbonsav —, a Coli baktérium szaporodásához nem használhatóik fel, sőt B12 jelenlétében antagonizmus folytán a növekedést gátolják. Ez nyilvánvalóan arra utal, hogy a kiegészítésükhöz szükséges egészen más természetű reszintézist, az amidálást, ez a baktériumtörzs nem tudja elvégezni. Az eticikdbalamin-karfoonsavak B12 vitaminná való reszintezésére tehát az eddig ismertek alapján a szintetikus amidálás és azt követő fermentációs nükleotid beépítése jöhet szóba. A módszer, tekintve az amidálás alacsony kitermelését (30—-40%) és az ezt követő fermentációval elérhető 160 gaimma/liter B12 szintet, gyakorlatilag számításba sem jöhet a jelenlegi, több ezer gamma/liter szintet elérő B12 vitamin ipari fermentációk mellett. Ismeretes, hogy a B12 vitaminnak olcsóbb ipari előállításainál — melyek kiindulási anyaga szennyvíziszap, vagy methanobaktériumos fermentlé —, igen jelentékeny mennyiségben nyerhető ki melléktermékként a nükleotid nélküli dezamidált faktorcsoport. PropionbaktériUim-Shermanii-val végezve a kísérleteiket -megállapítottuk, hogy a fermentáció során nemcsak a baktérium által termelt etiokobalamin, amint ezt a lengyel szerzők is megállapították, hanem az ennek többszörös mennyiségében hozzáadagolt etiokobalamin is megfelelő mennyiségű 5-6-dimetilbenzimidazol adásával komplet kobalaiminná alakítható. Jóllehet ez a kísérleti eredményünk fentiek alapján bizonyos fokig előrelátható volt, gyakorlatilag igen jelentős, mert lehetővé teszi a Coli transzformációs fermentációhoz képest 10—12-szeres B12 vitamin szint elérését. Továbbiakban azt találtuk, hogy a Propionbaktériumos fermentációval termelt B12 mennyisége nemcsak etiokobalamin (Faktor I., ill B.), hanem etiokobalaimnnkarbonsavak (dezamidált faktor B., ill. V.) hozzáadására is nagymérteikben növekszik, tehát a baktérium a hozzáadott etiokobalamin-karbonsavak jelentős részét is B12 vitaminná alakítja. Az átalakítás körülményeinek vizsgálatára vonatkozó kísérletsorozataink elvégzése után a következő megállapításokat tehettük: Propionbaktáriurn Shermanii a táptalajához adagolt etiokobalamin-karbonsavak túlnyomó részét a fermentáció során teljes értékű B12 vitaminná alakítja, kisebb hányadából változatlan etiokobalamin-karbonsav mellett dezamidált, de nukleotidot tartalmazó Bi2 homológot állít elő. A táptalajhoz adott etiokoibalamin-karbonsav mennyiségének növelésével a B12 szint a faktort nem tartalmazó, kontroll fermentáció értékének 6—5-«zörösét is elérheti, bizonyos szinten túl, a faktor ismételt adásával lehet további átalakítást elérni. A fermentáció kezdetekor adott etiokobalaminkarbonsav és benzimidazol lényegesen alacsonyabb B12 szintet eredményez, mint a logaritmikus függvény szerinti szaporodás végén, vagy ennél is később beadott azonos mennyiségek. Az átalakítás bármely, a baktérium szaporítására alikalmas táptalajon elvégezhető, Co^só adása nélkül. Dúsabb baktériumtenyészet és magasabb B12 szint érhető el olyan táptalajon, melyhez a cukorkomponenst külön sterilezve utólag adjuk hozzá. A faktorok adagolása mellett végzett Propionbaktériumos fermentáció a normál, vagy közvetlen fermentációhoz képest feltétlen előnyt jelent az elérhető többszörös B12 szint miatt és figyelembe véve ugyanezen szint mellett az anaerob fermentáció viszonylagos apparatúra és energiaigénytelenségét, az eljárás gazdasági előnyt jelent az aerob, közvetlen B12 fermentációkhoz képest. Végül a nagyságrendben nagyobb B12 koncentrációk és a dezamidált faktorok felhasználhatósága miatt úgy elvi, mint gyakorlati haladást jelent az ismert Coli baktériummal végzett etiokobalamin átalakítással szemben. A találmány szerint végzett bioszintézis természetesen ugyan úgy alkalmas arra is, hogy 5—6 benzimidazol helyett más bázist tartalmazó nukleotidát kapcsoljunk az etiokobalamin-karbonsavakhoz és itt is érvényesül az eljárásnak a magas szintek elérésével biztosított előnye. A fermentáció kivitelezését a példákban ismertetjük. A fermentáció menetének követésére a naponta levett mintákból pH meghatározást és Coli leimezes módszerrel összkobalamin-hatás meghatározást végeztünk. Ezenkívül a léből kicentrifugált baktériumok feltárása után Coli-módszerrel meghatároztuk a baktériumtestből kinyerhető hatóanyag — zömében B12 vitamin — mennyiségét. A fermentáció lefolytatása után minden fermentlevet feldolgoztunk a faktoroktól papírkromatografiával elválasztott, kolorimetrizálható tisztaságú B12 vitaminig. Példáinkban is ezen feldolgozásból kinyert B12 vitamin mennyiségét fogadtuk csak el értékelési alapul, tekintettel arra, hogy a fermentációhoz adott nagy mennyiségű dezamidált B-faktor a mikrobiológiai, vagy bármely más közvetlen meghatározás eredményét rendkívül befolyásolja. A fermentlé-minta feldolgozásánál a 144 339 sz. magyar szabadalmi leírásban ismertetett eljárást alkalmaztuk, amennyiben csapadékképző anyagok adagolásával a fermentleben specifikus baktériumkoagulációt idéztünk elő és a fermnetléből kiülepedett, baktériumokat tartalmazó csapadékot tártuk csak fel. A baktériummentes lé leöntésével a feldolgozásból kiiktattuk az át nem alakított, táptalajban visszamaradó faktorokat és a táptalajnak igen sok, a feldolgozást megnehezítő egyéb szennyező anyagát. A kicsapott, kiülepített baktériumokból a B12 vitamin teljes mennyiségét, kevés faktorszennyezéssel, viszonylag tiszta és koncentrált oldatban kaptuk meg. A fermentációhoz adagolt faktor mennyiségét a vele egyenlő szinértékű B12 mennyiségében adjuk meg, amennyiben az oldat koncentrációját dícián módosulatban Pulfrich S 52 szűrővel B12 standard mellett határoztuk meg. 1. példa: Propionbaktérium Shermanii törzzsel fermentációt végeztünk 6 liter térfogatban, fém fermentorban a következő táptalajon:
