146379. lajstromszámú szabadalom • Bioszintetikus eljárás etiokobalamin-karbonsavak B12 vitaminná való átalakítására
3 146.379 glukóz 1,0 % pepton (Richter) 0,5 % élesztő 0,2 % (H4 N) 2 S0 4 0,1 % KH2PO4 0,05% CaC03 1,0 % A táptalajt 110 C°-on 60 percig sterilezzük. A fermentációt 4% bouillon-táptalajon nőtt 78 órás inokulummal oltjuk be és 30 C°-on, kevertetve folytatjuk. 72 óra után 5 gamma/ml végkoncentráció eléréséhez szükséges kobalamin-karbonsav oldatot és 3 gamma/ml végkoncentrációban 5-6-dimetilbenzimidaziolt adunk hozzá, 96 óra után a fermentációt leállítjuk. A ferimentlé pH-ját 7,5-re beállítjuk és literenként 20—20 ml 10%-os alumíniumszulfát és ólomacetát oldatot adunk hozzá keverés közben, majd a pH-t NaOH-dal 8,0—8,2-re állítjuk. A keletkezett csapadékot centrifugáljuk és fermentlé-literenként 200 ml víziben, pH 6,0-ra állítva, kétszer kifőzzük. A főzetből a B12 vitamint bentonittal adszorbeáljuk, és a bentonitról ismert módon leoldjuk. Oldószeres továbbítás és koncentrálás után papírkromatográfiás elválasztást végzünk, majd a B12 frakciót kioldva, mennyiségét fotométerrel meghatározzuk. A kinyerhető Bj2 mennyisége 1014 gamma/ /liter fermentlé. A faktort nem tartalmazó, Co^só adása mellett ugyanígy lefolytatott 'kontroll fermentáció eredménye 285 gamma/liter. 2. példa: 5 literes üvegtermen torban 30—31 C°-on keverés közben, a következő táptalajon végzünk fermentációt: techn. szőlőcukor 2,0% kukoricalekvár 1,5% CaCOs 1,0%! A táptalajt 110 C°-on sterilezzük és 5% 70 óráé bouillon-tenyészettel oltjuk, be. A fermentációhoz 5 gamma/ml végkoncentrácíó eléréséhez szükséges' etiokobalamin-karbonsavat és 5 gamma/m] koncentrációig 5-6-dimetilbenziimidazolt adunk az I. fermentációnál 0 óraikor, a Il.-nál 72 óra után, a III. fermentációnál az 5-6-diimetilbenzimidazolt 48 ill. 72 óra után két részletben, a faktor-oldatot pedig 72 óra után adjuk be. Az 1. példa szerinti eljárással elvégezve, a feldolgozást a kinyert Bfa mennyiségek az I. fermentorból 640 gamma/liter II. fermentorból 1580 gamma/liter III. fermentorból 1965 gamma/liter fermentlé. 3. példa: 10 literes fémférmen torban 6 liter térfogatban fermentációt folytatunk a következő táptalajon: glukóz 1,0% kukoricalekvár 1,5% A pH-t NaOH-dal 6,8—7,0-re korrigáljuk a fermentlé sterilezése előtt és a fermentáció menete közben 14—24 óránként. 69 óra után a fermentorokhoz 5 gamma/ml koncentrációig etiokobalamin-karbonsavat és 5 gamma/ml koncentrációig 5-6-dimetilbenzimidazolt adunk és az I. fermentort 90 óra után leállítjuk, a II. fermentációnál 90 óra után a fenti beadagolást megismételjük és a fermentálást 120 óráig folytatjuk. Az 1. példa szerinti eljárással kinyerhető Bj2 mennyiségek az I. fermentornál 1220 gamma/liter II. fermentornál 2530 gamma/liter fermentlé. Irodalom: 1. ,Angerwandte Chemie 66, 776, 1954. 2. J. Chem. Soc. (London) 3849, 1953. 3. Biochem. J. 52, VIII. 1952. 4. Biochem. J. 56, XXXV. 1954. 5. Biochem. J. 58, XXIV. 1954. 6. Biochem. J. 59, 86, 1955. 7. Biochemische Zeitschrift 327, 422, 1956. 8. Acta Biochem. Polonica 1, 313, 1954. Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás etiokobalamin-karbonsavak bioszintetikus átalakítására, melyre jellemző, hogy etiokobalamin-karbonsavakat és nukleotid-bázist táptalajhoz adagolva a fermentációt Propionbaktérium törzzsel végezzük, majd a képződött komplet kobalamint izoláljuk. 2. Az 1. igénypont szerint eljárás kiviteli módja, melyre jellemző, hogy etiokobalaimin-karbonsavak és 5,6-dimetilbenzimidazol adagolásával cianokobalamint állítunk elő. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás kiviteli módja, azzal jellemezve, hogy az etiokobalamin-karbonsavakat és a nukleotid bázist a fermentáció menete közben, előnyösen a baktériumok logaritmikus függvény szerinti szaporodásának szakasza után adjuk a táptalajhoz. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás kiviteli módja azzal, jellemezve, hogy az átalakítás befejezte után ugyanazon fermentációhoz újabb faktormennyiséget és újabb nukleotid bázist adunk. A kiadásért felel: a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója 6057. Terv Nyomda, Budapest V., Balassi Bálint utca 21-23.
