146263. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az I-szpiramicin biokémiai átalakítására II- és III-szpiramicinné

146.263 5 A fenti táptalaj pH-értékét nátriumhidroxiddal ' 7,0-ra állítjuk be. A lombikokba letöltött táptalajt 30 percig sterilizáljuk 120 C° hőmérsékleten. Lehűlés után minden egyes lombik tartalmát beoltjuk a fenti módon elkészített inokulum 4'ml-jével, majd a lombikokat rázóasztalra helyezzük és 25 C° hőmérsékleten rázatjuk őket. 48 óra múlva kitűnő micéliumképződést tapasztalunk. Ezután minden egyes Erlenmeyer-lombikba 20—20 ml steril vizes oldatot adagolunk be, amely 12 g/liter tiszta I-szpiramicin-bázist és 6 g/liter nátriumpropionátot tartalmaz. A kultúrát ezután még 24 óra hosszat tovább keverjük a rázóasztalon, majd az összes lombikok tartalmát egyesítjük. A kapott fermentációs lé papírkromatográfiai elemzése azt mutatja, hogy az 2,6 g/liter át nem alakult I-szpiramicin mellett 1,4 g/liter átalakult . szpiramicin-elegyet tartalmaz; ez utóbbinak 20°/0-a II-szpiramicin, 80%-a pedig III-szpiramicin. 2. példa: 300 ml-es Erlenmeyer-lombikokba 40—40 ml-t töltünk az alábbi módon elkészített táptalajból: Élesztőkivonat 30 g Glükóz . 50 g Kalciumkarbonát 25 g Vízvezetéki vízzel feltöltve 1000 ml-re. A táptalaj pH-értékét a kalciumkarbonát hozzáadása előtt 7,0-ra állítjuk be. Ezután a táptalajt a lombikokban 30 percig sterilizáljuk 120 C° hőmérsékleten. Lehűlés után minden egyes Erlenmeyer-lombik tartalmát beoltjuk az 1. példában leírt körülmények között elkészített inokulum 4 ml-jével. A beoltott kultúrákat rázóasztalon keverjük 25 C° hőmérsékleten. 48 órai inkubáció után mindegyik Erlenmeyer-lombik tartalmához 20—20 ml 12 g/liter tiszta I-szpiramicin-bázist és 6 g/liter nátriumpropionátot tartalmazó steril vizes oldatot adunk, majd a kultúrákat további 3 napig inkubáltatjuk rázóasztalon. Ezután az összes Erlenmeyer-lombikok tartalmát egyesítjük. A kapott fermentációs lé kromatográfiai elemzése azt mutatja, hogy 2,1 g/liter még át nem alakult I-szpiramicin mellett 1,9 g/liter átalakult szpiramicin van jelen; az átalakult szpiramicin-elegy 6% II-szpiramicint és 94% Ill-szpiramicint tartalmaz. 3. példa: 300 ml-es Erlenmeyer-lombikokba 40—40 ml-t töltünk az alábbi összetételű táptalajból: Ammóniumklorid 6 g Glükóz 25 g Kalciumkarbonát 20 g Vízvezetéki vízzel feltöltve 1000 ml-re. Az Erlenmeyer-lombikok sterilizálása, beoltása és inkubálása a 2. példában leírt módon történik. 48 órai inkubálás után mindegyik lombik tartalmához 20—20 ml 9 g/liter tiszta I-szpiramicinbázist tartalmazó steril vizes oldatot adunk. A kultúrát további 3 napig rázatjuk, majd a lombikok tartalmát egyesítjük és elvégezzük a fermentációs termék kromatográfiai elemzését. Ennek során azt találjuk, hogy 0,78 g/liter I-szpiramicin nem alakult át, 2.22 g/liter pedig átalakult és olyan elegyet adott termékként, amely 87% II-szpiramicint és 13% Ill-szpiramicint tartalmaz. 4. példa: A S. ambofaciens kultúrát a 3. példában leírt módon készítjük el. Az I-szpifamicint tartalmazó oldattal 21 g/liter propionamidot is adunk a kultúrákhoz lombikonként 20 ml mennyiségben. A további 3 napi inkubáció után elvégzett kromatográfiai elemzés azt mutatja, hogy 1,86 g/liter I-szpiramicin alakult át, éspedig olyan eleggyé, amely 55% II-szpiramicint és 45% Ill-szpiramicint tartalmaz. Átalakulatlanul maradt 1,14 g/liter I-szpiramicin. 5. példa: A S. ambofaciens kultúrát a 3. példában leírt módon készítjük elő. A hozzáadott I-szpirarnicint tartalmazó oldattal 6 g/'liter nátriumpropionátot is adunk a kultúrákhoz. A fermentáció befej eztekor végzett papírkromatográfiai elemzés azt mutatja, hogy 0,96 g/liter I-szpiramicin maradt átalakulatlanul, 2.04 g/liter I-szpiramicin pedig olyan eleggyé alakult át, amely 11% II-szpiramicint és 89% Ill-szpiramicint tartalmaz. 6. példa: 300 ml-es Erlenmeyer-lombikba 40—40 ml-t töltünk be az alábbi összetételű táptalajból: Ammóniumklorid 10 g Glükóz 50 g Kaloiumkarbonát 25 g Vízvezetéki vízzel feltöltve 1000 ml-re. Az Erlenmeyer-lombikok tartalmának sterilizálása, beoltása és inkubáltatása a 2. példában leírt módon történik. 48 órai inkübáltatás után mindegyik Erlenmeyer-lombikba 6 g/liter nátriumpropionátot tartalmazó steril vizes oldatot adunk. Ezután az Erlenmeyer-lombikokat négy csoportba osztjuk. Az első csoportot változatlanul hagyjuk. A másik három csoport közül az egyikbe magnéziumszulfátot, a másikba vas(II)-szulfátot, a harmadikba pedig kobaltkloridot adunk, olyan menynyiségben, hogy mindegyik fém 1 millimól/liter koncentrációban legyen jelen az átalakításra alkalmazott közegben. 3 napi inkubáció után az egy-egy csoporthoz tartozó lombikok tartalmát egyesítjük, és az egyesített fermentációs leveket papír-kromatográfiai elemzésnek vetjük alá. Az elemzési eredményeket az alábbi táblázat mutatja: Aktivátor Az átalakult I-szpiramicin mennyisége g/liter A kétféle szpiramicin aránya %-ban II III Magnézium Vas Kobalt 7. példa: 1,88 2,12 2,32 2,80 21 79 28 72 30 70 27 73 A táptalajok betöltése, sterilizálása, beoltása és inkubálása 300 ml-es Erlenmeyer-lombikokban, a 6. példában leírt módon történik. 48 órai inkubá-