146263. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az I-szpiramicin biokémiai átalakítására II- és III-szpiramicinné

6 146.263 lás után az Erlenmeyer-lombikokat két csoportra osztjuk. Az első;

csoportbeli lombikok mindegyikében 20—20 ml 12 g/liter tiszta I-szpiramicin-bázist és 6 g/liter nátriumpropionátot tartalmazó steril vizes oldatot, a második csoportbeli lombikok mindegyikébe pedig 20—20 ml ugyanilyen, de még 30 g/liter nátriumkloridot is tartalmazó oldatot adunk. Mindkét csoportbeli lombikokat a fentebb leírt módon kezeljük; a papírkromatográfiai elemzés eredményeit az alábbi táblázat mutatja: NaCl g/liter Az átalakult I-szpiramicin mennyisége g/liter A kétféle szpiramicin aránya %-ban II III 0 10 8. példa: 1,88 2,60 21 23 79 77 300 ml-es Erlenmeyer-lombikokba 50—50 ml-t töltünk az alábbi összetételű táptalajból: Ammóniumklorid 10 g Glükóz 50 g Kalciumkarbonát 25 g Vízvezetéki vízzel feltöltve 1000 ml-re. A lombikok tartalmának sterilizálása, beoltása és inkubáltatása a 2. példában leírt módon történik. 52 órai inkubáltatás Után mindegyik Erlenmeyer-lombikba 1—1 ml 15%-os nátriumpropionát-oldatot adunk, majd a lombikokat két csoportba osztjuk. Az első csoportbeli lombikok mindegyikébe tiszta I-szpiramicin-bázis metanolos 15%-os oldatának 2—2 ml-jét adagoljuk. A második csoportbeli lombikok mindegyikébe tiszta I-szpiramicin-bázis ugyanilyen koncentrációjú és mennyiségű, de nem metanolos, hanem acetonos oldatát adjuk. A kultúrákat ezután még 72 óra hosszat inkubáltatjuk rázóasztalon. Utána az egyegy csoportbeli lombikok tartalmát egyesítjük és papírkromatográfiai módszerrel elemezzük. Az elemzés a következő átalakulási eredményeket mutatja: Oldószer Az átalakult I-szpiramicin mennyisége g/liter A kétféle szpiramicin aránya %-ban II III Metanol Aceton 9. példa: 3,48 3,36 24 27 76 73 A 300 ml-es Erlenmeyer-lombikok megtöltése az előző példa szerinti módon történik, ezután a lombikokat 30 percig sterilizáljuk 120 C° hőmérsékleten, majd minden egyes lombik tartalmát az 1. példa szerinti módon elkészített inokulum 6 ml-jével oltjuk be. A lombikokat rázóasztalon inkubáltatjuk, 25 C° hőmérsékleten. Ezután három csoportja osztjuk a lombikokat. 48 órai inkubáltatás után az első csoportbeli lombikok mindegyikébe tiszta I-szpiramicin-bázis metanolos, 15%-os oldatának 2 ml-jét adagoljuk. A második és harmadik csoportbeli lombikkba ugyanezeket az adalékokat adjuk, de 72, ill. 96 óra hosszat tartó inkubáltatás után. Az I-szpiramicin hozzáadása után még 3 napig folytatjuk az inkubációt, mindhárom csoport esetében. Utána az egyes csoportokon belül a lombikok tartalmát egyesítjük és papírkromatográfiai módszerrel megelemezzük a kapott fermentációs leveket. Az; eredményéket az alábbi táblázat mutatja: A szpiramicin Az átalakult hozzáadásáig eltelt I-szpiramicin órákban mennyisége g/liter A kétféle szpiramicin aránya %-ban I II 48 72 96 10. példa: 3,00 3,05 1,62 16 18 28 84 82 72 300 ml-es Erlenmeyer-lombikokba 50—50 ml-t töltünk az alábbi összetételű táptalajból: Ammóniumnitrát 13 g Glükóz 50 g Kalciumkarbonát 25 g Vízvezetéki vízzel feltöltve 1000 ml-re. Az Erlenmeyer-lombikokat 30 percig sterilizáljuk 120 C° hőmérsékleten, majd lehűtjük őket és beoltjuk az 1. példában leírt módon elkészített inokulum 5 ml-jével. A kultúrákat 3 napig inkubáltatjuk rázóasztalon, 25 C° hőmérsékleten, majd mindegyik lombikba 5 ml olyan vizes oldatot adagolunk, amely 100 g/liter tiszta I-szpiramicinbázist, 38 g/liter propionsavat és 10 g/liter kobaltklorid-hexahidrátot tartalmaz, és amelynek a pH-értékét nátriumhidroxid hozzáadása útján 6,5-re állítottuk be. A kultúrát ezután további három napig inkubáltatjuk, majd a lombikok egyesített tartalmát papírkromatográfiai módszerrel elemezzük. Az elemzés eredménye azt mutatja, hogy 8,70 g/liter Inszpiramicin alakult át, éspedig olyan eleggyé, amely 9% Il-szpiramicint és '91% III— szpiramicint tartalmaz. 11. példa: 300 ml-es Erlenmeyer-lombikokba 50—50 ml-t töltünk az alábbi összetételű táptalajból: Ammóniumnitrát 20 g Keményítő 60 g Kalciumkarbonát 25 g Vízvezetéki vízzel feltöltve 1000 ml-re. A lombikokba letöltött táptalaj sterilizálása, beoltása és a kultúra inkubáltatása a 2. példában leírt módon történik. 96 órai inkubáltatás után mindegyik Erlenmeyer-lombikba 5—5 ml olyan vizes oldatot adunk, amely 140 g/liter nyers szpiramicin-bázist (összetétele 59, 27, ill. 14% I-, II-, ill. Ill-szpiramicin), 56 g/liter propionsavat és 0,5 g/liter kobaltklorid-hexahidrátot tartalmaz, és amelynek a pH-értékét nátriumhidroxid-oldattal 6,5-re állítottuk be. Ezután a kultúrákat még további három napig inkubáltatjuk, majd a lombikok egyesített tartalmát papírkromatográfiai módszerrel elemezzük. A hozzáadott 8,25 g/liter I^szpiramicinből 6,30 g/liter alakult át olyan eleggyé,