146263. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az I-szpiramicin biokémiai átalakítására II- és III-szpiramicinné

4 146.263 Utóbbi esetben azonban — ha az átalakulás megfelelő irányát biztosítani kívánjuk — célszerű az I-szpiramicint az acilezőszerek és az aktivátorok hozzáadása után beadagolni. Azt találtuk továbbá, hogy bizonyos esetekben előnyös, hogy az I-szpiramicinnel, az acilezőszerekkel és az aktivátorokkal egyidejűleg még valamely energiaforrást, mint pl. glükózt vagy keményítőt is adunk a rendszerhez. Ez különösen olyan esetekben fontos, amikor a fermentációs közegből elkülönített S. ambofaciens micéliummal dolgozunk és az eredeti fermentációs közeget az I-szpiramicint, acilezőszert és aktivátort tartalmazó új közeggel helyettesítjük. A glükózt vagy keményítőt 1 és 50 g/liter közötti koncentrációban adhatjuk a közeghez; a legelőnyösebb koncentráció 10 g/liter körül van. Olyan esetekben, amikor átalakító közegként magát az acilező enzimrendszer kialakítására szolgált közeget használjuk fel, az átalakítás lefolytatása céljából hozzáadott anyagok beadagolása célszerűen egy meghatározott pH-tartományon belül, általában 5,0 és 8,0 pH-érték között, előnyösen azonban 6,0 és 7,0 pH-érték között történik. Az átalakításnak a lehető legkedvezőbb feltételek melletti lefolytatása érdekében célszerű lehet a kultúra pH-értekét adott esetben megfelelően módosítani a beadagolandó anyagok hozzáadásakor. Erre a célra különböző savas vagy alkalikus kémhatású anyagok alkalmazhatók, ezek megválasztása során azonban tekintettel kell lenni arra, hogy ne alkalmazzunk az átalakulási reakciót esetleg gátló anyagokat. Jól felhasználhatók ilyen célra pl. a sósav, kénsav, salétromsav, ecetsav, propionsav, citromsav, továbbá a nátrium-, kálium-, ammónium-, kalcium- vagy báriumhidroxid. Abban az esetben, ha az átalakítást az enzimrendszer kialakítására alkalmazott közegből elkülönített és az átalakítandó I-szpiramicint, acilezőszert és aktivátort tartalmazó közegbe átvitt S. ambifaciens micéliummal folytatjuk le, szintén előnyös jól meghatározott pH-feltételek mellett dolgozni. Ilyenkor is fentebb említett savas vagy alkalikus anyagok hozzáadásával szabályozhatjuk a pH-t 3,0 és 8,0 közötti értékre. A pH-érték szabályozása történhet puffer-anyagok, mint pl. ecetsav és acetát, propionsav és propionát, citromsav és citrát vagy f tálsav és ftálát elegyének hozzáadása útján is. Végül, bármilyen módon történjék is az átalakítás, előnyös lehet, ha pH-értéknek az átalakulás folyamán esetleg bekövetkező változásait megfelelő savas vagy alkalikus anyagok, vagy pufferelegyek hozzáadása útján ellensúlyozzuk. Az I-szpiramicin II- és III-szpiramicinné való átalakításához tökéletesen aerob körülmények között kell a S. ambofaciens kultúrát tartani, amikor az enzimrendszer kialakítására szolgáló kultúrát vagy az abból elkülönített micéliumot felhasználni kívánjuk. Ezért az átalakításra szolgáló közeget az átalakításhoz szükséges különböző anyagok hozzáadása után hasonló szellőzési és keverési körülmények között kell tartani, mint amilyeneket az enzimrendszer kialakítása során is fenntartottunk. Az acilező enzimes átalakítás lefolytatása során a hőmérsékletnek — a szokásos reakciófeltételek fenntartása esetén — viszonylag csekély a fontossága. Általában 15 és 40 C° közötti hőmérsékleten dolgozhatunk; a legkedvezőbb hőmérséklet 25 C& körül van. Az I-szpiramicin II- és III-szpiramicinné való átalakítása viszonylag gyorsan folyik le; az. I-szpiramicin lényeges részének átalakulása 24 óra alatt befejeződik. Az átalakítás maximális hozamának biztosítása érdekében azonban bizonyos esetekben célszerű lehet, ha elegendő hosszú ideig tartó érintkezést tartunk fenn az acilező enzimrendszer, a szpiramicin és a többi adalékanyag között; így az átalakító rendszer teljes kifejlődésének biztosítására több napi időtartam is szükséges lehet. Ha az I-szpiramicinnek II- és III-szpiramicinné való átalakítása az alább leírt módon már befejeződött, az átalakítási termékek elválasztása ismert módszerekkel, pl. ellenáramú megoszlásos elválasztással, alumíniumoxidon vagy más adszorbensen való kromatografálással, vagy frakcionált kristályosítással történhet. Ha az átalakítás folyamán vagy annak befejezte után egyszerű módon meg akarjuk állapítani a jelenlevő különféle szpiramicinek mennyiségi arányát, úgy az átalakító közeget célszerűen papírkromatográfiai módszerrel vizsgálhatjuk, és a kapott papírkromatogramot olyan kromatogramokkal hasonlítjuk össze, amelyeket tiszta állapotban elválasztott különböző szpiramicinek ismert mennyiségeivel készítettünk. Az alábbi példák szemléltetik az I-szpiramicin S. ambofaciens kultúrák segítségével II- és III-szpiramicinné történő átalakításának gyakorlati kiviteli módját; a találmány köre azonban természetesen nincsen ezekre a példákra korlátozva. 1. példa: Egy 2. literes Erlenmeyer-lombikba 250 ml-t töltünk az alábbi összetételű táptalajból: Kukoricalekvár (50%-os száraz kivonat) 40 g Keményítő 20 g Nátriumklorid 5 g Magnéziumszulfát 1 g Monokáliumfoszfát 2 g Vízvezetéki vízzel feltöltve 1000 ml-re A közeg pH-értékét nátriumhidroxiddal 6,8-ra állítjuk be, majd még az alábbi adalékot adjuk hozzá: Kalciumkarbonát 5 g. Az így elkészített táptalajt 45 percig sterilizáljuk 120 C°-os hőmérsékleten. Lehűlés után az inokulum elkészítése céljából beoltjuk és S. ambofaciens törzs zselatinon nevelt kultúrájával. A kultúrát ezután 48 óra hosszat rázóasztalon keverjük 25 C° hőmérsékleten. Másrészről, 300 ml-es Erlenmeyer-lombikokba 40—40 ml-t töltünk az alábbi összetételben elkészített táptalajból: . Kukoricalekvár (50%-os száraz kivonat) 45 g Glükóz 50 g Kalciumkarbonát 25 g Vízvezetéki vízzel feltöltve . 1000 ml-re