144525. lajstromszámú szabadalom • Eljárás elasztolitikus enzimkészítmény előállítására
2 144.525-csökkentjük; az oldatból az elasztolitikus enzimet megfelelő adszorbensen megkötjük, majd az adszorbensről az enzimet sót tartalmazó, vízzel elegyedő szerves oldószer híg vizes oldatával leoldjuk, az enzimet az oldatból a szerves oldószer töménységének növelésével kicsapjuk és a csapadékot a folyadéktól elkülönítjük. Az elasztolitikus enzim kivonatolásálhoz szárított hasnyálmirigyport, előnyösen acetonnal szárított pankreászport használunk. A kivonást 10—15 térfogat % szerves oldószert tartalmazó, gyengén savanyú vegyhatású pufferoldattal végezzük; kivonatolhatunk azonban 2—5% szerves, vagy szervetlen sót tartalmazó 38—52 térfogat % szerves oldószert tartalmazó oldattal is. Pufferként célszerűen acetát vagy ftalát-puffert, vízzel elegyedő szerves oldószerként alacsony szénatomszámú alkoholokat, vagy acetont alkalmazunk. Az alacsony alkoholkoncentrációjú vizes kivonatból az adszorpció előtt az alkoholt lepároljuk, vagy az oldatot erősen meghígítjuk. A szerves oldószeres frakcionálási alacsony hőmérsékleten, —2 C° és — 10 C° között végezzük; az adszorpciót és a leoldást szobahőmérsékleten. Ez utóbbi művelethez 8—12% szerves sót tartalmazó 30—50 térfogat %-os vizes metanolt vagy etanolt használunk. Szerves oldószerben oldódó sóként ammóniumkloridot, litiumkloridodt, előnyösen ammóniumacetátot alkalmazunk. Az aktív elasztolitikus enzimet mind az alkoholos frakcionálási eljárás során, mind az adszorpciós módszer kivitelezésekor az alkoholkoncentráció 76—82 térfogat %j ra történő emelésével csapjuk ki oldatából. Az alacsony hőmérsékleten elkülönített enzimet aztán vízmentes oldószerekkel mossuk és szárítjuk, vagy pedig híg, savanyú vegyhatású acetátpufferes oldás után oldatából fagyasztott állapotból szárítjuk. 2. példa 100 g hasnyálmirigyport (Pankreatin, Richter) szobahőmérsékleten 2 részletben összesen 1500 ml 5% ammóniumacetátot tartalmazó 38 térfogat %-os vizes etanollal kivonatolunk. Az oldatlan maradékot centrifugálással különítjük el. A két kivonatot egyesítjük, majd hűtőszobában —2 C°-ra hagyjuk lehűlni. Lehűlés közben finom, porszerű csapadék ülepszik ki az edény aljára, amely javarészt hatástalan fehérjéket tartalmaz. Ezt hideg szobában, vagy hűtött centrifugában történő ülepítéssel különválasztjuk, majd a tiszta fölöttes léhez annyi hűtött abszolút etanolt adunk vékony sugárban, állandó keverés közben, hogy az oldat etanolkoncentrációja 50—53 térfogat% legyen. Az ilyenkor képződő csapadékot, amely tömegében szintén hatástalan szöveti fehérjékből áll, 6 elasztikus aktivitást csak csekély mértékben mutat, ülepítéssel különválasztjuk s a tiszta fölöttes lé etanolkoncentrációját hűtött abszolút etanol hozzáadásával 76—82 térfogat%-ra emeljük. Az ekkor nyert csapadékot, amely az enzimaktivitás jelentős mennyiségét képviseli, centrifugálással összegyűjtjük, majd abszolút etanollal, abszolút, aldehidmentes acetonnal mossuk és szárítjuk. A termék szárítását végezhetjük azonban fagyasztott állapotból is. Ez esetben úgy járunk el, hogy a hidegen összegyűjtött csapadékot kis mennyiségű abszolút etanollal néhányszor kimossuk, majd M/200—M/50 pH 5,0 acetátpufferben oldjuk és szűrés után az oldatot fagyasztjuk és lyofilizáljuk. Fenti úton 85—95%-os hozammal olyan terméket nyerünk, amely a kiindulási anyagnál 10—12X hatásosabb. 2. példa 1000 g acetonnal zsírtalanított' és szárított hasnyálmirigyport 2 részletben összesen 20 liter 15 térfogat% metanolt vagy etanolt tartalmazó M/10 pH 4,8—5,0 acetát-pufferrel kivonatolunk. A kivonást a szervpor megnedvesítése és eldörzsölése után 1—2 órai időtartamú szobahőmérsékleten történő kevertetéssel végezzük. Ezután az oldatlan maradékot 3—4000 fordulatszámú 30—60 perc időtartamú centrifugálással elkülönítjük s a fölöttes levet deszt. vízzel 5—8X~rosára hígítjuk, vagy pedig a kivonatbó a szerves oldószert alacsony hőmérsékleten, vákuumban lepároljuk. Az egyesített, víztiszta, enyhén sárgaszínű kivonatot ezután 2,5— 3,0 kg-os töltetű, NH4 + -ciklusban aktívált szintetikus Na-zeolit oszlopon engedjük átfolyni, 1—2 liter óránkénti átfolyási sebességgel. Az oszlop 8—10 cm átmérőjű, magassága 100—120 cm. Az elasztolitikus enzim a gyengén savanyú vegyhatású oldatban kationként viselkedik s így a szintetikus zeolit oszlopra adszorbeálódik. Az oszlopról kifolyó oldatban alig mutatható ki enzimaktivitás, az adszorpció hatásfoka 80—90%. A kivonat utolsó részletét 3—5 liter M/50—M100 pH 5,0 acetátpufferrel szorítjuk le az oszlopról, ezután az adszorbenst deszt. vízzel mossuk az acetát reakció negatívvá válásáig. A szintetikus zeolit-oszlopon megkötött enzimet az oszlop kimosása után 10% ammóniumacetátot tartalmazó 40 térfogat%-os vizes etanollal vagy metanollal oldjuk le. Az eluáláshoz 4—6 liter oldószert használunk. Az oszlopról kifolyó oldószer megjelenését acetát és Biuret-reakcióval indikáljuk. A leoldás befejeztével az alkoholos enzimoldatot hűtőszobába helyezzük és —2—5 C° közti hőmérsékletre hűtjük. A lehűlt oldathoz annyi hűtött abszolút etanolt vagy metanolt adunk vékony sugárban, állandó keverés közben, hogy az alkohol koncentrációja 76—84 térfogat% legyen. Ez általában 2—3 térfogat alkohol hozzáadásával érhető el. A kicsapott enzimet másnapig hidegszobában tároljuk; ez idő alatt jól kiülepszik, a fölöttes lé leszívható. A laza, finom eloszlású, pelyhes csapadékot centrifugálással gyűjtjük össze s kismenynyiségű abszolút etanollal kimossuk. Ezután deszt. vízben, vagy M/100—M/200 pH 4,6—5,0 acetátpufferben oldjuk és fagyasztott állapotból szárítjuk. Az adszorbensen a leoldás befejezése után híg ammóniát engedünk át, majd a zeolitot NH4 + ciklusban aktíváljuk; az ammónia fölösleget M/100— M/500 HCl-val szorítjuk ki, végül deszt. vízzel mossuk neutrálisra az oszlopot. Ezáltal újabb adszorpcióra tettük alkalmassá. Az ismertetett úton olyan enzimkészítményt nyerünk 40—50%-os hozammal, amely a kiindulási terméknél 40—70X nagyobb elasztolitikus aktivitást mutat.
