143549. lajstromszámú szabadalom • Eljárás B12 vitaminnak egyéb elektroneutrális kobalaminfaktorokból való elválasztására
Megjelent: 1957. augusztus hó 1-én, ORSZÁGOS TALÁLMÁNYI HIVATAL SZABADALMI LEÍRÁS 143.549. SZÁM 30. h. 1—8. OSZTÁLY — Ri—136. ALAPSZÁM Eljárás Bú-vitaminnak egyéb elektro* neutrális kobalaminfaktoroktól waló elválasztására Bejelentő: Richter Gedeon Vegyészeti Gyár rt., Budapest, Feltalálók: dr. Molnár Béla kutatóvegyész, Valu József gyógyszerész, mind a ketten budapesti lakosok Bejelentés napja: 1955. április 20. B1£ -vitamin előállítására túlnyomórészt az antibiotikum (streptomiein, aureomicin, terramicin stb.) fermentációk anyalúgjait használják. —Ismeretesek ezenkívül aerob és anaerob körülmények között végzett olyan baktériumos fermentálások is, amelyek kifejezetten csak B12-vitamin előállítását célozzák. Ugyancsak baktériumok által termelt Bi2 -vitamin nyerhető a szennyvíz-üledéknek . vagy állati trágyának aerob vagy anaerob baktériumos lebontása útján is, ami tehát olyan fermentációnak tekinthető, melyet nem aszeptikus körülmények között és nem tiszta baktérium-tenyészettel végeznek. Míg azonban a streptomioin-fermentáció anyalúgjában található növekedési faktor általában gyakorlatilag tiszta cianokobalaminból áll, addig az egyéb, főképp a baktériumos fermentációk sok B-vitaminnal rokon anyagot is termelnek, melyeknek csak egy része hatásos farmakológiailag. Az irodalom ezekből a B12-vitaminnal rokon anyagokból, az ún. „faktorokból" már 10-nél is többet ismertet és megadja a B12 -vitamintól való megkülönböztetésükre szolgáló jellemzőiket és elválasztásuk lehetőségeit. Ezek a módszerek kimondottan mikropreparatív eljárások és alapelvük a papírelektroforézis és papírkromatografia. Az elektroforézis során a különböző pufferben mutatott elmozdulások, ill. vándorlási sebességek, a papírkromatografia során a leggyakrabban a szekunder-butanol-víz oldószerekkel végzett megoszlásos kromatográfia révén nyert Rf értékek azok az adatok, melyekkel az egyes faktorokat jellemezni és elválasztani lehet. Kísérleteink során megállapítottuk, hogy a városi szennyvíz szüredékének metános rothasztása után visszamaradó iszapból kapott B12 -vitamint tartalmazó koneentrátumokban jelentős mennyiségben 5 kísérő faktor van jelen. Az ilyen koncentrátumokból a jól kristályosodó cianokobalamint az ismert víz-acetanos kristályosítással csak igen rossz hozadékkal lehet kinyerni, mert a megfelelő aceton-koncentráció elérésével kristálykiválás helyett általában olajos csapadék válik ki. Alacsonyabb aceton-koncentrációval elérhető ugyan a cianokobalamin kristályos kiválása, de amellett, hogy a kristály-nyeredek igen alacsony, megállapítottuk, hogy a kapott kristályos termék nem egységes anyag, hanem jelentékeny mértékben tartalmaz kísérő faktorokat. Ezeket a kísérő faktorokat ismételt átkristályosítással sem lehet eltávolítani, mert a B-vitaminnal elegykristályt alkotnak és elválasztásukra ez idő szerint csak a korábban említett módszerek használhatók. Ezek a módszerek inkább tudományos értékűek és analitikai eljárásként használhatók, de ipari termelésre már mikropreparatív jellegüknél fogva sem alkalmasak. A találmány tiszta kristályos B12 -vitamin előállítását célozza faktorokat tartalmazó koncentrátumaiból. A kísérő faktorokat 'közelebbről "tanulmányozva megállapítottuk, hogy azok egy része bázikus természetű és így a cianokobalamin izoelektromos pontja körüli pH értéken elektroforézissel vagy ioncserélő gyantával egyaránt eltávolíthatók. A bázikus jellegű faktorok nagyobb mennyiségben, pl. 10 százalékot meghaladó mennyiségben való jelenléte a kristályosításnál már olajos kiválást okoz, de a tiszta B-,„-vitaminnal elegykristályt nem képez. Ha tehát ezek a bázikus természetű faktorok nagyobb mennyiségben vannak jelen, úgy célszerű azokat az említett módszerek valamelyikével eltávolítani. Az elektroforézissel el nem választható: ún. elektroneutrálls maradékban van jelen a B-vitamin és az bár már olajképződés nélkül kristályosodik, a faktorok neutrális természetű csoportjával elegykristály formájában kristályosodik. A. tiszta B,2 -vitaminnak ezektől az elektroneutrális faktoroktól való elválasztása a találmány szerint a következőképpen történik. A túlnyomórészt neutrális kobalaminokat tartalmazó vizes oldatot apoláris oldószer és fenol (fenolszármazék) elegyével, előnyösen .1:6 tf-arányú fenol-kloroform keverék célszerűen csökkenő mennyiségével ismételten kirázzuk. Az oldószeres fázisokat egyesítjük a térfogatuk negyed-, majd nyolcad részét kitevő vízzel kimossuk. A mosóvíz elválasztása után a megmaradó oldószeres fázisból a hatóanyagtartalmat Brockmann-féle alumíniumoxiddal kiadszorbeáljuk. Az adszorbenst közvetlenül is hozzáadhatjuk az oldószeres fázishoz. Az adszorpciót a'osz. aceton hozzáadásával tesszük teljessé. Az alumíniumoxid téglavörösre színeződik és a folyadékfázis sárgásbarna színűvé világosodik ki. Az elegyet fel-
