143376. lajstromszámú szabadalom • Eljárás riboflavin mikrobiológiai úton való készítésére

Megjelent 1956. október hó 1-én ORSZÁGOS TALÁLMÁNYI HIVATAL SZABADALMI LEÍRÁS 143.376. SZÁM 30. h. 1—8. OSZTÁLY — Ka—481. ALAPSZÁM Eljárás riboflavin mikrobiológiai úton való készítésére Szegedi Orvostudományi Egyetem Vegytani és Biokémiai Intézete. A bejelentő által megnevezett feltalálók: Krámli András és Szabó Sándor szegedi lakosok. Bejelentés napja: 1955 január 6. Ismeretes, hogy anyagcseretermékként számos mikroorganizmus termel riboflavint. Különösen az Eremothecium ashbyii és az Ashbya gossipii azok, melyek riboflavinterrnelése igen jelentős. A riboflavin-gyártás céljára ma különösen az Eremothecium ashbyii törzs levegőzött tenyészetét használják, melynek termelőképességét főleg a legmegfelelőbb táptalaj megválasztásával, vagy a táptalajnak a fermentáció alatt történő folyamatos pótlásával lehet fokozni -Vizsgálataink szerint mikroorganizmusok anyagcseréje a tenyészetek redoxpotenciáljának (RP) mesterséges úton való megváltoztatásával fokozható. Megállapítottuk azt is, hogy valamely mikroorganizmus RP-görbéje az anyagcsere szempontjából három jellemzőre bontható. A görbe első része, amelyben az RP csökken, megfelel a tenyészet növekedési fázisának. A második rész, amelyben az RP emelkedik, termelési fázisnak nevezhető; főleg erre az időre esik ugyanis a sejtek anyagcseretermékeinek a táptalajban való felszaporodása. A harmadik fázisban, ahol az RP állandó, a táptalajban az anyagcseretermékek mennyisége már nem növekszik. Azt is megállapítottuk, hogy egy anyagcseretermék felszaporodására az RP görbe emelkedő részének egy határozott intervalluma jellemző. Ha tehát valamely anyagcseretermék keletkezését fokozni kívánjuk, a tenyészet termelési fázisát kell megnyújtanunk. Ezt általában úgy érhetjük el. hogy olyan RP-csökkentő anyagokat viszünk a tenyészetbe, amelyek a kérdéses anyagcseretermék szintézisét irányító enzimek működését nem gátolják. Kísérleteink szerint a tenyészetben a bevitt idegen anyagok aszerint változtatják meg a tenyészet RP-ját, hogy beépülnek-e a sejtekbe vagy sem. Utóbbi esetben a bevitt idegen anyag hatására beállt RP-változást a tenyészet kipuffereli, mert a bevitt anyagok redoxkapacitása a sejtekéhez viszonyítva általában elenyésző. E tapasztalatok vezettek bennünket arra a gondolatra, hogy a termelési fázis meghosszabbítását úgy érhetjük el, hogy a riboflavin termelésre használt tenyészetet egy fiatalabb tenyészettel elegyítjük, ez utóbbi ugyanis állandóan termeli az RP-csökkentő tényezőket, és mivel a tenyészet RP-ja az ott előforduló összes redoxrendszerek által létesített RP-ok eredője, a tenyészet RP-ja a fiatalabb tenyészet hatására alacsonyabb lesz és így a termelési fázis meghosszabbodik. E megfigyelésünk alapján az alábbi példában megadott eljárás szerint sikerült az Eremothecium ashbyii szellőzött tenyészeteinek robiflavin termelését fokozni. Példa: A riboflavin készítéséhez szükséges Eremothecium ashbyii tenyészeteket vattával körülvett alumíniumból készült négyfúratú dugóval lezárt 1 literes Erlenmeyer lombikokban készítettük. A dugó furataiba helyeztük el az RP mérésére alkalmas elektródokat, a levegőztető csövet és a mintavevőt. Az így összeállított tenyészeteket mágneses ingarázógépen rázattuk. A szellőzés a tenyészetek mélyére benyúló levegőztető csövön keresztül történt. A szellőzéshez szükséges levegőt kis elektromos membránkompresszor szolgáltatta. Az RP-t kalomelelektróddal szembekapcsolt platina vagy arany elektródon mértük. A kalomelelektródnak a tenyészettel való összekapcsolására agyaglemezzel lezárt KCl-agar csövet használtunk. A termelt riboflavin mennyiségét a szokásos módon koloriínetrikusan határoztuk meg. A tenyészetek felbontása után a riboflavint kristályosan izoláltuk. Az összes kísérleteket 25 Q°-os thermostat fülkében végeztük. Kísérleteinkhez a budapesti Országos Közegészségügyi Intézetből származó Eremothecium ashbyii törzset használtunk. Táptalaj: 25 g III. gen anyaélesztőt 100 ml dest. vízben 2 ATÜ nyomáson 20 percig autolizáltunk. A lehűlés után az autolizátum felső tiszta részét táp- . talaj készítés céljára dekán tál tuk vagy szűrtük. A táptalaj összetétele a következő volt-20 ml élesztőfőzet, 80 ml dest. víz. 0,5 g pepton. 2,0 g glukóz A táptalaj pH-ját NaOH-al 7,0-re állítottuk, majd 1 literes Erlenmeyer lombikba 100 ml-t töltve 110 C°-on 15 percig sterilizáltuk. A beoltást 5 ml, hasonló táptalajon előtenyésztett inokulummal végeztük.