142779. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szpiramicin előállítására
6 142.779 származó antibiotikus hatás szabályosan növekszik az erjedés megindulásától fogva. Noha a levegőztetés nem kritikus tényező és nagy határok közt változhat, előnyös, ha a levegőztetéshez minden liter húslevesre percenkint 0,5—2 liter levegőt használunk. A szpiramicint a fermentált levekből különféle módszerekkel különíthetjük el. Eddigi tapasztalataink szerint az oldószeres kivonatolás mutatkozott előnyösnek. Használhatunk olyan oldószert, amely a maradékcefrében meghagyja az erjesztéssel egyidejűleg keletkezett anyagokat, pl. a kongocidint. Olyan oldószert is alkalmazhatunk, amely e tisztátalanságok egy részét kivonja, melyeket azután a további kezelés folyamán távolítunk el. Ezt a kivonatolást a fermentált cefre szűrése után hajtjuk végre; ehhez olyan szűrési segédanyagokat használunk, amelyek pH-ja 7 és 9 között van. A kivonatolást pH 8 és 11 között, előnyösen pH 9-en végezzük, olyan oldószer segítségével, amely nem keveredik vízzel és amely az alábbi csoportokba tartozik: alkoholok (különösen butanol), alifás ketonok (metil-etil-keton, metilizobutil-keton ...), halogénezett alifás szénhidrogének (kloroform), aromás szénhidrogének (benzol) és észterek, mint etil- vagy amil-acetát. Az így kapott oldatot savanyúan reagáló vízzel (pH 4-nél kisebb, előnyösen 2 és 3 között) kivonatoljuk. A vizes oldatot ezután töményítjük, majd pH 9-en kloroformmal vagy benzollal kivonatolunk. A szerves oldatot ezután töményítjük, dehidráljuk, kénsawal pH 5-re beállítjuk, az antibiotikum szulfátját pedig éterrel kicsapjuk. Az először kapott szerves oldószeres kivonatot közvetlenül is töményíthetjük, a tömény kivonatot vízzel pH 2-őn kivonatoljuk és ezt a vizes kivonatot az előbbiek szerint kezeljük. Az így nyert nyers szulfátot ezután szerves oldószerekkel, vagy vízzel, vagy kromatografikus úton folytatólagos kivonatolással tisztíthatjuk. Az alábbiakban az eljárás kivitelezésére néhány példát közlünk, anélkül azonban, hogy ezek a találmány körét szűkítenék. A választott egység egy bizonyos tisztított terméknek az a legkisebb menynyisége, amely — alkalmas tenyészközeg 1 cm3 ében oldva — megakadályozza a staphylococcus aureus (F.D.A. ^209 P törzs) fejlődését; a szóbanforgó termékre vonatkoztatva ez a mennyiség egyenlő 1 mokrogrammal. 1. példa Az alábbi közegnek kukorioalekvár (50 %-os száraz kivonat) — — — • — — 4 % súlyrész glukóz ______ 2 o/0 kalciumkarbonát — — 0,5 % >> nátriumklorid — — — — 0,5 % ,» magnéziumszulfát — — 0,1% „ 40 literét 75 literes erjesztőkészülékbe töltjük. A pH értéket 7,0-ra állítjuk be és a keveréket 45 percen át 120 C°-on sterilizáljuk. A közeget 26 C°-ra hűtjük és Erlenmeyer-féle lombikban rázott S.3486 tenyészet 250 cm3 -ével beoltjuk. Az erjesztőkészülékben a tenyészetet levegőztetjük és 25 óra hosszat rázzuk. Ezzel a tenyészettel a szaporítótenyészetet oltjuk be. Ez utóbbit 350 literes erjesztőkészülékben állítjuk élő, melybe az alábbi közeg 200 literét töltjük: glukóz — — — — — 2 % súlyrész szójaliszt száraz gabonamoslék — — 0,5 %• nátriumklorid — — — — 2 % .. kalciumkarbonát — — — 1 ,° '0 Sterilizálás előtt a pH érték 6,8. A szaporítótenyészet fejlődése nem nagyon gyors; 3—4 nap után befejezettnek tekinthetjük, miközben a tenyészetet 26 C°-on tartottuk, levegőztettük (12 cm3 levegő/óra) ós perceiikint 400 fordulatszámmal ráztuk. A pH érték eleinte 6,4-re esik, majd kb. 30 óra után mintegy 7,5-re emelkedik. A 4. nap végén a nyert aktivitás egyenlő 92 egységgel cm3 -enkint. 2. példa 350 literes erjesztőkészülékbe az alábbi közeg 200 literét töltjük: glukóz — — • — — — 1 % súlyrész kukoricalekvár (50%-os száraz kiv.) — — — — 3 % ,, kálium-dihidro-foszfát —• — 0,1 % magnéziumszulfát — — — 0,1 % ,, nátriumklorid — — — 2 % „ kalciumkarbonát — — — 0,5% » A pH értéket szódával 7,0-ra állítjuk be és a közeget 45 percen át 120 C°-on sterilizáljuk. A közeget ezután 26 C°-ra hűtjük, majd az 1. példában ismertetett módon beoltjuk. A fermentált terméket ezután levegőztetjük és rázzuk. A maximális aktivitást 60 óra után kapjuk és az megfelel 129 egységnek/cm3 . 3. péZda Ügy erjesztünk, mint a 2. példában, de a glukózt 2 % súlyrész nádcukorral helyettesítjük és a kukoricalekvár mennyiségét 2 % súlyrészre csökkentjük. Ilyen feltételek mellett a maximális aktivitás 40 óra után 90 egység cm3 -enként. 4. példa 30 literes erjesztőkészülékben az alábbi közeg 15 literét töltjük: glukóz _____ 3 % súlyrész. élesztőautolizátum — — — 1 % ,, nátriumklorid — — — — 2 % „ magnéziumszulfát — — — 0,1 % „ kálium-dihidro-foszfát — — 0,1% ,, kalciumkarbonát — -— — 0,5 % ,, A pH értéket szódával 7,0-ra állítjuk. Ezt a közeget, miután sterilizáltuk és 26 C°-ra lehűtöttük, erjesztőkészülékben beoltott, korábban ismertetett kukoricalekváros közeg 1 literével oltjuk be. Olyan tenyészetet kapunk, amelynek hatékonysága 4 nap múlva 144 egység cm3 -enkint. 5. példa pH 8 értékű cefrés tenyészet 210 literéhez szűrési segédanyag (Supercel Hyflo) 10 kg-ját adjuk, majd szűrőprésen szűrünk. A szűrési lepényt 50 liter vízzel mossuk. A szűredéket, mely 230 litert tesz ki és 15,8 millió egységet tartalmaz, 10 %-os szódaoldattal pH 9-re lúgosítjuk és 46 liter metil-izobutil-ketonnal kivonatoljuk. Az oldószert elkülönítjük és a vizes fázist 23 liter metíl-izo-
