142705. lajstromszámú szabadalom • Eljárás magas B12-vitamintartalmú májkivnat előállítására
2 142.705. pepszinnel elfolyósított májból készített kivonatok módszeres* tisztítását megakadályozzák. Foglalkoztunk egyebek között az irodalomból ismeretes módszerrel is, amely autolizált máj őrleményből állít elő vizes máj kivonatokat. Megállapítottuk, hogy szokásos módon végrehajtott autolizis esetében, amikor finomra őrölt májat antiszeptikum jelenlétében (toluol, kloroform, fenol, stb.) 1—2 napon át saját kateptikus enzimei segítségével 37—40° C-on elfolyósítunk, majd az elfolyősított masszából forró vizes kivonatokat készítünk, Bi2-vitaminban változó, sokszor igen alacsony, máj kg-ként 50—300 gamma Bi2-vitamint tartalmazó vizes kivonatokat nyerünk. Egyes esetekben— előttünk ismeretlen okokból — a termelés jobb volt, ami megmutatta, hogy a máj — néhány az irodalomban fellelhető feltételezés szerint is -— ennél jóval több Bi2-vitamint tartalmaz. (Erre mutattak egyébként pepszinnel végzett kísérleteink is.) Kísérleteinkből végül is arra kellett következtetnünk, hogy a szokásos módon végrehajtott autolizis alatt a Bi2-vitamin bomlása következett be. E bomlás megakadályozására számos kísérletet végeztünk, amelyek eredményét az alábbiakban foglalhatjuk össze: 1. Ha májkivonatok enzimeit hőkezeléssel inaktiváljuk, majd azt az irodalomból ismert módszerekkel előállított tisztított katepszinkészítménnyel (1. pl. Talián—Jones—Fonton: On the proteolytic enzymes* of animal tissues. J. Biol. Chem. 194, 793— 805, 1952) kezeljük, a Bi2-vitamin bomlása nem következik be. A kateptikus kezelés következtében a májfehérjék mélyreható hidroütikus bomlást szenvednek s a B12-vitamint jó termeléssel tudjuk ennek folyományaképpen ballasztanyagoktól megszabadítani. A katepszines kezelés különösen pepszines előkezelés után bizonyult igen hatásos^ nak. A Bi2-vitaminban kapott termelés 600—800 gamma Bi2/kg máj, minden ismert korábbi adatot jelentősen meghaladó! 2. A máj saját kateptikus enzimeit is felhasználhatjuk a fehérjék lebontására a Bi2-tartalom csökkenése nélkül, ha az autolizist 4.3-nál nem magasabb pH-nál végezzük. Kísérleteink szerint az autolizis ill. a fehérjék hidrolízise pH 3.6—4.3 között elég nagy sebességgel végbemegy és az ilymódon autolizált májból pH 6-nál készített forróvizes kivonatok adszorpciós módszerekkel, igen jó termeléssel tisztíthatók, Bi2-tartalmuk ugyancsak 600— 800 gamma/kg máj. Az 1. pontban ismertetett módszereknél nem előfeltétel az alkalmazott katepszin magas tisztasága. Vizsgálataink szerint állati vese és lép egyszerű vizes kivonatai nem tartalmaznak B12 bomlását okozó anyagokat (lásd 2. példa). E szervekből készült nyers vizes kivonatokat mégis célszerű frakcionált kisózás vagy oldószeres kicsapással az inert fehérjék főtömegétől megszabadítani, nehogy a májkivonatba fölös fehérjeszennyezéseket vigyünk be (lásd 1. példa). Katepszinnel le tudjuk bontani egészen mélyrehatóan a májkivonatokban oldott fehérjéket, aminek a Bia-vitaminban nyert hozam, szempontjából messzemenő következményei vannak. Ellenőrző kísérleteink szerint nem proteolizált, vagy kizárólag pepszinnel kezelt májból csak y2 —V3. annyi vitamint tudunk előállítani, ha äz izolálasi folyamat első lépésében szénre történő adszorpciót és a szénről való leoldásra alkoholos leoldási alkalmazunk. Ez az izolálasi (tisztítási) módszer legalkalmasabb a nyers kivonat feltöményítésére és az eredetinél mintegy 20—40-szer tisztább kivonatokat eredményez. Ezzel a módszerrel tisztított kivonatban 1 kg csak pepszinnel proteolizált májból 150—• 350 gamma mikrobiológiai módszerrel (Escherichia Coli, vagy Lactobacillus Lechmanni-val) mérhető Bi2-vitamint tudunk előállítani és meghatározni, eljárásunk szerint készített kivonatok ugyanekkor 600—800 gammányit tartalmaztak/kg. Még szembetűnőbb a különbség a vitamin továbbtisztíthatóságát illetően. A pepszinnel proteolizált májból nyert kivonat kémiai és fizikai szempontból heterogén módon viselkedő vitamint tartalmaz és teljes letisztítása olyan nehézségekbe ütközik, hogy közben annak 60—80%-át elveszítjük, míg pl. olyan tisztaságú készítményhez jutunk, melynél 1 mg. szárazanyagra 2 gammányi B12-V1-tamin esik. Találmányunk szerint proteolizált májból nyert kivonat tisztítása eddig a tisztaságig mintegy 70% hozammal valósítható meg. Eljárásunk alkalmazása lehetővé tette, hogy a kromatográfia módszerének igénybevétele nélkül előállíthatunk intravénásán is adagolható májkivonatokat,, amelyek alkalmasak arra is, hogy kristályos Bia-vitamin előállításához kiindulási anyagul szolgáljanak Eljárásunkat az alábbiakban néhány példával szemléltetjük, amelyek szerint egyszerű eszközök és folyamatok alkalmasak arra, hogy a találmány szerint proteolizált májból értékes gyógyszerkészítményeket állítsunk elő. A tisztítás egyes fázisaiban követett módszerek az irodalomból ismeretesek, de csak az általunk kidolgozott fehérjelebontási módszer tette lehetővé, hogy azok megfelelő módon és sorrendben alkalmazva és eljárássá egye^ sítve jó hozamot és magas tisztasági fokú készítményt eredményezzenek. Példák: 1. 1 kg marhamájat húsdarálón megőrölünk és 0.5% fenolt tartalmazó 2 1. vízzel elkeverjük, majd a keverék pH-ját sósavval 2.5-re állítjuk be. A savanyú szuszpenziót ezután 5 g gyógyszerkönyvi minőségű pepszinnel kezeljük 40 C°-on, miközben a pH-t állandóan 2.0—2.5-re korrigáljuk. A máj ezen idő alatt főtömegében feloldódik és a keverék felhígul. Ezután a pH-t 5.8—7.0 közé állítjuk be
