142705. lajstromszámú szabadalom • Eljárás magas B12-vitamintartalmú májkivnat előállítására

142.705. 3 (NaOH) és 95—100 C-ig felhevítjük a folyadékot, tnajd megszűrjük. A 35—40 C°-ra lehűtött szüredékhez ezután ty2

kg lépnek megfelelő katepszint adunk, melyet Bergmann és munkatársai szerint frakcionált kisózással (Journal of Biol". Chem. 1952. 194) állítottunk elő és fagyasztva-szárítással tartósítottunk 4.5—5.0 közé beállítva az oldat pH-ját, 24 órán át 36—40 C°-on tartjuk, majd a pH-t 6.0—7.0-re felemelve gyorsan felhevítjük 95—98 C°-ig. A még meleg oldatot centrifugán derítjük, majd 100 g aktív szénnel kezeljük V2 órán át. A Bi2-vitamin a szénre adszorbeálódik, melyet leszűrünk és alaposan leöblítjük vízzel. A szárazra leszívatott adszorbensről a vitamint hígított alkohollal (60—70%-os) eluáljuk, míg az alkohol már csak alig színes. Az alkoholos oldatot 40 C° alatti hőmérsékleten bepároljuk 100 ml-re, majd a besűrített oldatot hideg helyen állni hagyjuk és szűrjük. A szüredéket ezután ammonszulfáttal telítjük, mire vöröses színű csapadék válik ki, amely a Bi2-vitamin főtömegét tartalmazza. A csapadékot kevés vízben feloldjuk (50—100 ml.) és fenolkloroform 1 :6 arányban készített keverékével kimerítően kivonatoljuk. A vitamint tartalmazó vörös színű oldószerelegyet 30 C° alatti hőmérsékleten kloroformmentesítjük és a visszamaradó fenolos oldatot 10-szeres térfogat éterrel és mintegy 50 ml. vízzel rázzuk össze, mire a vitamin a vizes fázisba megy át. A vitamint tartalmazó vizes oldatot ezután butanolos kirázásokkal az inert anyagok főtömegétől megszabadítjuk, pH-ját 7.0—7.2 közé állítjuk be, feloldunk benne 15% ammonkloridot és négyszer egyenlő térf. butanollal kivonatoljuk. Ezután a vizes fázist enyhén megsavanyítjuk (pH 3.0—4.0) és az előbbi módon fenol-kloroformmal kivonatoljuk, végül a vitamint a kloroform lepárlása után ismét vizes fázisba visszük át, amely a nyers kivonat vitamintartalmának 70—80%-át tartalmazza kevés inert szárazanyag mellett. Az utolsó vizes oldat a Bi2-vitaminre jellemző ibolyavörös színű. Átlagosan 100—200 mg inert szárazanyag mellett 3—500 gamma vitamint tartalmaz. 2. példa. 1 kg marhamájat az 1. példában ismertetett módon pepszinnel hidrolizálunk, a vizes szuszpenzió pH-ját beállítjuk 4.5—5.0 közé és 250 g marhalép vizes kivonatát (500 ml.), melyét előzőleg centrifugálással derítettünk. A kivonat őrölt lépből antiszeptikum hozzáadása (toluoí) után hideg helyen (0 C°) való egynapos digerálással készült. Az enzimes kezelést, akárcsak az 1. példában, 35—40 C-on, 24 órán át folytatjuk. Utána az oldatot semleges kémhatás mellett felforraljuk és tisztára szűrjük centrifugán vagy nuccson. A vitamin tisztítása az előző példában ismertetett módon történik. Tökéletesen végrehajtott proteolizis után az ammonszulfátös kiesapást elhagy* A kiadásért felel a Nyomtat hatjuk, amivel bizonyos vitaminveszteséget el tudunk kerülni. Így tehát az eluáló alkohol lepárlása után visszamaradó vizes oldatot azonnal ienol-kloroformmal kivonatoljuk. 3. példa. 10 kg marhamájat megőrölünk és 15 1., 50 ml tömény sósavat és 100.ml elfolyósított fenolt tartalmazó vízzel alaposan elkeverjük. A keveréket ezután erőteljes keverés mellett 35—40 C°-ra felmelegítjük és pH-ját 3.9—4.1 közé állítjuk be. Az erőteljes keverést 6 órán át folytatjuk és a keverék pH-ját állandóan a megadott értékre korrigáljuk. Néhány óra múlva az önmagát pufferező keverék pH-ja állandóvá válik. A keveréket még 20 órán át 35—40 C° hőmérséklettel rendelkező helyen tartjuk, majd pH-ját 6.5—7.0-re visszük fel és gyorsan 95—98 C°-ig felhevítjük. Ezután a felhígult szuszpenziót megszűrjük vásznon. Az így nyert kivonatból a Bi2-vitamint az 1. és 2. példákban ismertetett módon különítjük el. E példákban ismertetett eljárással 4—6 mg vitamint állíthatunk elő 10 kg májból. A vizes oldat szárazanyaga mg-onként mintegy 4 gamma vitamint tartalmaz. Oldószeres és kromatográfiás eljárással csekély veszteség mellett továbbtisztítható. Szabadalmi igénypontok. 1. Eljárás Bia-vitamint magas tisztasági fokban tartalmazó, májkivonat előállítására azzal jellemezve, hogy kivonatolás előtt a máj saját enzimjeit denaturálva a májfehérjéket más állati szervekből készült kateptikus enzimekkel 3.8—5.2 pH-jú vizes közegben hidrolitikusan lebontjuk, vagypedig a fehérjelebontást'a máj saját kateptikus enzimeivel 3.8—4.3 pH-jú közegben végezzük el, majd a két módszer egyikével hidrolizált májból készült vizes kivonatot magában véve ismert módszerekkel a ballasztanyagok túlnyomó többségétől megtisztítjuk. 2. Az 1. pontban ismertetett eljárás kivitelezési módja azzal jellemezve, hogy az emésztéshez állati belső szervekből készített vizes kivonatokat, vagy ezekből előállított tisztított kateptikus enzimeket alkalmazunk. 3. Az 1. és 2. igénypont szerinti eljárás kivitelezési módja azzal jellemezve, hogy a kateptikus enzimekkel való kezelés előtt a májfehérjéket pepszinnel vagy pepszint tartalmazó anyagokkal előzetesen lebontjuk. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás kivitelezési módja azzal jellemezve, hogy az enzimes kezelés irtán nyert vizes kivonatot szénnel jkezeljük, a szenet alkohollal eluáljuk, az alkoholos oldatot, besűrítjük, a besűrített oldatot ballasztanyagok eltávolítására butanollal, a Bi2-vitamin kinyerésére pedig fenolvízzel nem keveredő szerves oldószer elegyével kivonatoljuk, végül pedig utóbbiból a vitamint ismét vizes fázisba visszük vissza. inyellátó Vállalat igazgatója 892. Terv Nyorrtda, 1955. — Felelős vezető: Bolgár Imre