142705. lajstromszámú szabadalom • Eljárás magas B12-vitamintartalmú májkivnat előállítására

Megjelent: 1955. évi június hó 30-án. ORSZÁGOS TALÁLMÁNYI HIVATAL SZABADALMI LEÍRÁS 142.705. SZÁM. 30. h. 1-8. OSZTÁLY. — GO-244. ALAPSZÁM. Eljárás magas BI2

->itamin tartalmú máj kivonat előállítására Bejelentő: Gyógyszeripari Kutató Intézet, Budapest.Feltalálók: dr. Molnár István és Mertha Gusztávné Kelemen Agnes. A bejelentés napja: 1952. október 22. A vészes vérszegénység szuverén gyógyszere a máj, illetve ennek legfontosabb hatóanyaga, a B12-vitamin. E gyógyszerek leghatásosabban parenterálisan adagolhatok, e célra pedig csak kellő mértékben tiszta készítmények alkalmazhatók. Májinjekciók ballasztanyagai túlnyomórészt a májfehérje lebontásából eredő polipeptidek, melyek molekulasúlya és összetétele a kivonásra és tisztításra alkalmazott eljárások szerint változik. A máj injekciók értékeléséhez szükséges legfontosabb adatok: a készítmény Bi2-vitamin tartalma, a ballasztanyagok mennyisége, ezenfelül a polipeptidek átlagos molsúlya is, mivel magas molsúlyú polipeptidek a B-vitamin molekulákhoz kapcsolódva annak felszívódását a szervezetben s így hatásosságát is befolyásolni képesek. Tapasztalatunk szerint magas hatóanyagtartalmú, kevés ballasztanyagot tartalmazó készítmények csak oly módon állíthatók elő, ha a májfehérjét előzetesen olyan mértékben bontjuk le kis molekulasúlyú komponensekre, hogy azok a vitamin fizikai tulajdonságait (oldhatóság, dializáihatóság, megoszlási egyensúly a különböző oldószerfázisok között) többé ne befolyásoljak. Megállapítottuk, hogy magas molsúlyú polipeptideket tartalmazó nyers májkivonatok tisztítása és belőlük a Bi2-vitamin előállítása a legnagyobb nehézségekbe ütközik és csak igen rossz hozammal kivitelezhető. A májfehérjék lebontását csak enzimek segítségével végezhetjük el a hatóanyag károsodása nélkül, mert utóbbi magasabb hőmérsékleten és szélső pH-értékeknél bomlást szenved. Parenterálisan alkalmazott májkészítményeket régebben is készítettek különböző enzimek segítségével. Leggyakrabban pepszinnel (őrölt állati gyomor, gyomornyálkahártya) találkozunk az irodalomban, de használtak erre a célra tripszint és papaint is. Idegen szervből eredő enzimmel való kezelés helyett alkalmaztak autolizist is, azonban Sem az autolizis időtartamára, sem -egyéb körülményeire (pH!) nem találunk olyan előírásokat, amelyekhez ragaszkodva veszteség nélkül elő lehetne állítani az antiperniciózás hatóanyagot. A Bi2-vitamin felfedezése előtt ilyen módszer kidolgozása márcsak azért is nagy nehézségbe ütközött volna, mivel a hatóanyagtartalmat csupán vészes vérszegénységben szenvedő betegeken lehetett meghatározni s e meghatározási módszer többszáz százalékos hibalehetőséget hordoz magában. A Bi-ä-vitamin felfedezése (1948) után ismeretessé vált mikrobiológiai meghatározási módszerek és az a tény, hogy megismerték a főhatóanyag kémiai és fizikai sajátságait is, jobb májkoncentrátumok előállítását tették lehetővé. Igyekeztek a főhatóanyagot minél jobban megtisztítani a ballasztanyagoktól és ecélból továbbra is megkísérelték enzimek segítségével a kísérő fehérjéket leépíteni és azok hasadási termékeit eltávolítani. Legsikeresebben a papaint alkalmazták, ezen.enzim pH-optimu^mának megfelelő pH-birodalomban a Bi2-vitamin vizes oldatában elég stabilan viselkedik. A még le nem bontott peptideket pedig további tripszines kezelésnek is alávetették (Fantes és tsai Proc. Roy. Soc. Vol. 136. 592—613). Vizsgálataink arra mutattak, hogy a máj „feltárásának" döntő szerepe van abban, hogy a szervkivonatok mennyi Bi2-vitamint tartalmaznak, különösen nagymértékben függ a ballasztanyagok minőségétől és mennyiségétől a kivonatok tisztításának lehetősége. Magas molekulasúlyú fehérjék, vagy fehér jebomlási termékek a vitamin oldékonysági viszonyait, adszorbeáló képességét különösen erősen befolyásolják és jó hozammal történő tisztítását megakadályozzák. Mi a májfehérjék kismolekulasúlyú komponensekre (aminosavak) való lebontását katepszinnel igyekeztünk elvégezni, amely — mint az állati szövetek igen elterjedten előforduló enzimje — nagymennyiségben, olcsón áll rendelkezésre!. A katepszin pH és hőmérsékletoptimumánál a Bi2-vitamin vizes oldataiban stabilis s ezért az olcsó enzim használata is indokoltnak látszott. A mikrobiológiai analitikai meghatározás módszere lehetővé tette, hogy az irodalomból ismeretes enzimes emésztési módszereket felülvizsgáljuk és azok hibáit feltárjuk. Így megállapítást nyert, hogy pepszines emésztésnél Bi2-vitaminban — az alacsony pH értékek ellenére — sem szenvedtünk el nagyobb veszteséget, de az emésztésnél keletkező nagyobb molekulasúlyú fehérjehasadási termékek a