142529. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nagytisztaságú B12-vitamin tartalmú májkészítmény előállítására
142.529 3 és megszűrjük. Tiszta rózsaszínű oldatot kaptunk, aminek szárazanyagtartalma 2—3 mg/kcm. Bi2 tartalma pedig 40—50 gamma/kcm, tehát tisztasági foka 0.1—0.05 mg/l gamma B12 vitamin. Az alábbiakban a találmány szerinti eljárás részleteit néhány példa kapcsán közöljük. A találmány azonban nincs a példákra korlátozva. Így a találmány kiterjed minden olyan eljárásra, mely az enzimhatások kiküszöbölését vagy csökkenését lehetővé, teszi. Nem érinti a találmányt a koncentrációs viszonyok, az időtartamok, a pH értékek változtatása sem. Lényeges része a találmánynak az euzinhatások kiküszöbölésével kapott májkivonatnak egy lépésben végzett aktív szenes továbbtisztítása. 1. példa: 10 dg darált májat 15 1 csapvízzel jól átkeverünk és 24 órára 5 C° alá hűtött tárolóba helyezzük. Ezután keverés közben 1 y3 órán át 60 C°-on tartjuk, majd gyorsan 88—90 C°-ra melegítjük és ezen a hőmérsékleten kisajtoljuk. A présmaradékot 7 1 vízzel ismét elkeverjük, 1 órán át 60 C°-on tartjuk, majd 88—90 C°-ra melegítve megint kipréseljük. Az egyesített préslevekhez 400 g aktív szenet adunk és keverés közben 1 órán át 50—-55 C°on tartjuk, majd leszűrjük. A szenet 3 1 60 C°-os vízzel, majd 6 1 30—35 C°-os 6 %-os fenoltartalmú vízzel, utána 10 1 50 C°-os, végül 5 1 60 C°-os meleg vízzel átmossuk. A mosóvizeket elöntjük és a szénréteget monst 12 1 67 %-os 60°-ra melegített etanollal, végül 1 liter 90 %-os, szintén 60 C°-ra melegített alkohollal eluáljuk. Az egyesített eluátumot vákuumban 45 C° alatt 3—400 kcm-re bepároljuk, a sűrítmény pH-ját 4.4— 4.5-re állítjuk és pár órára jeges vízben lehűtjük. A kivált csapadéktól centrifugálással elkülönítjük, a tiszta szupernatánst a fenolnyomok eltávolítása céljából kétszer 100 kcm éterrel kirázzuk, majd az oldatot az éternyomok elűzésére rövid ideig vízfürdőn porcellántálban melegítjük. Utána az oldatot szükség szerint megszűrjük és térfogatát 500 kcm-re egészítjük ki. Halvány, sárgás rózsaszínű oldatot nyertünk, aminek B12 tartalma 10—-15 gamma/kcm, szárazanyagtartalma 0.5—1.5 mg/l gamma B12-VÍ-tamín. Az anyag macska-vérnyomásméréssel vizsgálva 0.2 kcm adagban' állat-kg-ként 0.2 gamma histaminbázissal egyező süllyesztést okoz. 2. példa: 10 kg darált friss marhamájat 12 1 csapvízzel elegyítve keverés közben gyorsan 65 C°-ra melegítünk, másfél órán át ezen a hőmérsékleten tartva keverünk, végül a hőmérsékletet 95 C°-ra emeljük, majd az elegyet nyomószűrőre visszük, és a folyadékot kisajtoljuk. A présmaradékot 6 1 vízzel ismét elkeverjük, ugyanúgy mint az előzőben melegen kivonatoljuk. Ezután 12—18 cm 0-ű, szűrőfenékkel ellátott csőben, 400 g aktív szén és 200 g diatomaföld keverékéből a szokásos módon szűrőoszlopot készítünk, és ezen az oszlopon az egyesített présleveket átnyomatjuk, miután a hőmérsékletét 65—70 C°-ra felemeltük. Az oszlopot utána 3 1 35 C°-ra melegített 6 %-os fenolos vízzel, majd 12 1 65 Cc --os meleg vízzel átmossuk. Ezután 60 C°-ra melegített 67 %-os alkoholt nyomatunk át az oszlopon, összesen mintegy 15 litert, mindaddig, míg a lefolyó eluatumnak valami halvány színe is van. Az alkoholos eluátumot vákuumban 45 C° alatti hőmérsékleten 2—300 kcm-re besűrítjük és' a koncentrátumot lehűlés után 4-es pH-ra állítjuk. Egy éjjelen át jégszekrényben való tárolás után a kiváló csapadékot lecentrifugáljuk, a szupernatánst éterrel vagy kloroformmal kirázzuk, az oldószer nyomait vízfürdőn elűzzük, végül tisztára szűrjük és pH-ját 6-ra, térfogatát pedig friss deszt. vízzel 500 kcm-re állítjuk be. Halványsárgán rózsaszínű oldat B12 tartalma 12—15 gamma/kcm, tisztasági foka 0.5—1 mg/l gamma Bi2-vitamín között van, vérnyomáscsökkentő hatása 0.2 kcm/állat-kg-ként kevesebb mint 0.2 gamma histaminbázisé. 3. példa: 10 kg friss marhamájat 15 1 víz hozzáadása közben kolloidmalmon ledarálunk. Az elegyhez 0.5—1.5 ezrelék KCN-ot teszünk és a 7.5—8-ra beálló pH-t 2n sósavval 6.5—7-re állítjuk. Elszívó fülke alatt 60 C°-ra melegítjük, 1 órán át ezen a hőmérsékleten keverjük, majd 90 C°-ra melegítve kipréseljük. A présmaradékot hasonló módon 6 1 vízzel mégegyszer kivonatoljuk, majd az egyesített présleveket a 2. példához hasonló módon aktív szénnel adszorbeáltatjuk. A szénréteg kimosását, leoldását és az eluátum bepárlását ugyanúgy végezve 300 kcm-re bepárolt koncentrátumot nyerünk, aminek pH-ját 4-re beállítva jeges vízben lehűtjük. A csapadék lecentrifugálása után 0.3 g KCN-ot adunk az oldathoz és 1 órán át 52 C°-ra melegítjük. Az oldatot ezután 40 g aktív szénből készült oszlopon átnyomatjuk, majd az oszlopot 400 kcm 40 C°-os 5 %-os fenolos vízzel, végül 1200 kcm 65—70 C°-os meleg vízzel átmossuk. Az oszlop elüálására kb. 800 kcm 67 %-os meleg alkoholt használunk és az eluálást addig folytatjuk, míg a lefolyó alkoholos oldat rózsaszínű. Utána 80 kcm 90 %-os meleg alkohollal is átmossuk az oszlopot és az egyesített eluátumot vákuumban 45 C° alatti hőmérsékleten 30—40 kcm-re bepároljuk. Az intenzív rózsaszínű folyadékot lehűlése után, ha zavaros, centrifugáljuk vagy szűrjük, a fenolnyomoktól éterrel kirázzuk, az éter kiűzése után deszt vízzel 100 kcm térfogatra állítjuk be. Tiszta, intenzív rózsaszínű oldatot nyerünk, melynek a Bi2-vitamín tartalma 60— 80 gamma/kcm, tisztasági foka 0.1—0.5 mg/l gamma Bia-vitamín, 0.2 kcm/1 kg állatsúly adagban kisebb vérnyomáscsökkentést okoz mint 0.1 gamma histaminbázis. Irodalom: Waiden & Clowes: Proc. Soc. Exp. Biol, and Med. 29. 873 (1932).
