Somogyi Múzeumok Közleményei 13. (1998)

Csapó János-Csapó Kiss Zsuzsanna-Nyberg J. Csapó János Jr. Varga Visi É.: Hogyan, mire és milyen korlátokkal lehet használni az aminosavakat és az aminosavak raciminációját fosszilis anyagok korának meghatározása az archeometriában?

FOSSZILIS ANYAGOK KORÁNAK MEGHATÁROZÁSA 187 A fossziliákból mért D- és L-aminosavak arányának értéke függ attól, hogy milyen módszert alkalmaznak az aminosavak kivonására és meghatározására. Különböző eredményeket kaphatunk a szabad, a fehérjében kötött vagy az összes aminosav vizsgálatakor, de az eltérés oka lehet az enzimes-, a gázkromatográfiásvagy a nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás módszerek közötti, a módszer sajátságából eredő hiba is. Az aminosavak izolálására a fossziliákból az elmúlt években különböző eljárásokat dolgoztak ki, melyek elég sok azonos elemet tartalmaznak. Általános a minta mechanikai tisztítása, mosása, és az ultrahang használata a hozzátapadt szennyező anyagok eltávolítására (BADA és PROTSCH, 1973; VEHMILLER és HARE, 1971). A mintát ezt követően szárítják és megőrlik, majd az így kapott homogén őrlemény már kész az aminosavak extrakciójára. A mintát mossák híg sósavval a szabad aminosavak kioldására, majd a szabad aminosav tartalmú oldatot szűréssel eltávolítják az aminosavakat kötött állapotban tartalmazó oldhatatlan maradéktól (DUNGWORTH és mtsai, 1975). A szabad aminosavak - esetleg sómentesítés után - ekkor már készek a D- és L-aminosavak meghatározására. Az oldhatatlan maradékot az aminosavanalitikában általánosan használatos 6 mólos sósavval 22-24 órán át 100-110 °C-on hidrolizálják, a hidrolízis befejeztekor a sósavat bepárlással eltávolítják, a maradékot desztillált vízben feloldják, majd sómentesítik. A sómentesítésre egyesek a hidrogénfluoridos lecsapást (a kalcium eltávolítása) (VEHMILLER és HARE, 1971), mások pedig a hidrolizátum kation-, illetve anioncserélő gyantán történő átvezetését alkalmazzák (KVENVOLDEN és mtsai, 1971). Nem szerencsés a minta előkészítése és az aminosavak kinyerése közben lúgos kezelést alkalmazni, mert az aminosavak lúgos hatásra igen hajlamosak a racemizációra, és azt az előkészítés folyamán mindenképpen kerülni kell. Az aminosav enantiomerek szétválasztására és meghatározására több módszert is kidolgoztak. Kezdetben használták a polarimetriát, amit elsősorban tiszta aminosavak racemizációjának tanulmányozására alkalmaztak (BADA, 1971; 1972a; SATO és mtsai, 1970). Enzimes technikát használtak a D- és L-aminosavak meghatározására talajból ALDAG és mtsai (1971) és néhány fossziliából HARE és ABELSON (1967), HARE (1969) és PETIT (1974). Ennek az eljárásnak a lényege a D- vagy az L-aminosavak oxidációja, majd az ezt követő aminosav meghatározás. A módszer hibája, hogy nem használható a D-aminosavak nyomnyi mennyiségeinek kimutatására, és igen jelentős hibaforrás lehet az enzimekből származó L-aminosavakkal történő szennyezés. Az optikailag aktiv (királis) aminosavak reakciója királis reagensekkel diasztereomer vegyületet eredményez, melyek elvben nem királis oszlopon is szétválaszthatok. Amennyiben a királis reagens egy másik aminosav, akkor a diasztereomer dipeptidek elválasztása és meghatározása ioncserés oszlopkromatográfiával is megoldható. MANNING és MOORE (1968), CSAPÓ és mtsai (1990, 1991) ioncserés oszlopkromatográfiás eljárást írtak le a D- és L-aminosavak szétválasztására. Az eljárás lényege egy L-aminosav Nkarboxi anhidridnek illetve aktív észternek a vizsgálandó D- és L-aminosavakkal lejátszódó reakciója, melynek során diasztereomer dipeptidek keletkeznek, melyek alkalmasak az ioncserés szétválasztásra. MANNING és MOORE módszerével BADA és PROTSCH (1973) rutinszerűen analizált csontból aszparaginsavat L-Leu-D-Asp és L-Leu-L-Asp diasztereomer dipeptid formájában. A D- és L-aminosavak szétválasztására az egyik legjobb módszer - a nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia mellett - a gázkromatográfia. Az enantiomereket szét lehet választani egy megfelelő aszimmetrikus reagenssel létrehozott diasztereomer-pár formában, vagy az illékonnyá tett származékokat egy optikailag aktív álló fázison kell szeparálni. CHARLES és mtsai (1963) az N-trifluoracetil-(+)-2-n-alkoholokat használták a diasztereomerek képzésére. Ezt a módszert tökéletesítették (+)-2-n-butanol alkalmazásával POLLACK és mtsai (1965), és tették alkalmassá a szerves geokémia számára KVENWOLDEN és mtsai 1971-ben. Az elsőnek alkalmazott optikailag aktív stacionáris fázis a gázkromatográfiában az N-trifluoracetil-L-izoleucin-lauril észter volt, melyet GIL-AV és mtsai szintetizáltak 1966-ban. CHARLES és mtsai (1975) az N-lauril-L-valil-tercier-butilamidot alkalmazták és találták nagyon jónak az optikai izomerek szétválasztására. A gázkromatográfiás technikát ma már olyan tökéletesre fejlesztették, hogy az enantiomerek meghatározásának hibája kisebb mint 5 %, és a reprodukálhatóság is rendkívül jó. Újabban az enantiomerek szétválasztására és meghatározására egyre inkább teret nyer - az előzőekben említett módszerek rovására - a nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia. WEINSTEIN és WEINER (1984) az aminosavakból az 5-dimetil-aminonaftalin-1szulfonil fluoreszkáló származékot képezték és fordított fázisú folyadékkromatográfiával az N.N'-di-n-propil-Lalanin (L-DPA) és réz acetát királis töltet alkalmazásával az összes fehérjealkotó aminosav D- és Lenantiomerjét szét tudták választani egy mintából. Véleményük szerint a módszer mennyiségi meghatározásra kiváló, érzékeny, és gyors, a módszer továbbfejlesztése során az aminosav analízishez hasonló módszerré alakulhat. MARFEY (1984) ugyancsak nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás módszert fejlesztett ki az enantiomerek szétválasztására. Az 1-fluor-2,4-dinitrofenil-5-L-alanin-amid segítségével - mely egy igen reakcióképes fluor atomot tartalmaz - diasztereomer származékokat hozott létre D- és L-aminosavak keverékéből. Ezeket a származékokat nagy nyomású folyadékkromatográfiával trietil-aminfoszfát és acetonitril