Somogyi Múzeumok Közleményei 13. (1998)

Csapó János-Csapó Kiss Zsuzsanna-Nyberg J. Csapó János Jr. Varga Visi É.: Hogyan, mire és milyen korlátokkal lehet használni az aminosavakat és az aminosavak raciminációját fosszilis anyagok korának meghatározása az archeometriában?

188 CSAPÓ J. - CSAPÓ KISS ZS. - NYBERG J. -.CSAPÓ J. JR. - VARGA VISI É. eluensek megfelelő gradiensét alkalmazva igen jó eredménnyel szét tudta választani és mennyiségileg meghatározni. Közleményében a D- és L-aszparaginsav, glutaminsav, metionin, alanin és fenilalanin elegyének szétválasztását közli, de a feltételek megfelelő változtatásával lehetőség van a többi aminosav enantiomerek szétválasztására is. Biológiailag aktív anyagok optikai tisztaságának ellenőrzésére KNABE (1984), GÜBITZ és MIHELLYES (1984), GÜBITZ és mtsai (1982) egy direkt módszert dolgoztak ki nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiával. A módszer lényege a királis oszlop, mely kémiailag kötött L-hidroxiprolin-Cu

2+ komplexből áll. A mozgó fázis Cu

2+ tartalmú vizes oldat. A fenti stacionáris fázis alkalmazásával mód nyílik mindazon vegyületek optikai tisztaságának ellenőrzésére, melyek kelát komplexeket képeznek a Cu

2+ ionokkal, amilyenek például az aminosavak. A módszer hibája az előzőekben említettekhez képest az, hogy egyszerre csak egy aminosav Dés L-alakját lehet vele meghatározni. Az aminosav enantiomerek mennyiségi meghatározásához nem elég csak az enantiomereket egymástól elválasztani, de ügyelni kell arra is, hogy az enantiomerek a többi aminosavtól vagy azok származékaitól is jól elkülönüljenek. Ezen túl, a megfelelő érzékenység elérésére kis mennyiségben is jól detektálható aminosav származékot kell képezni. Az utóbbi időben erre a célra széles körűen alkalmazták a fluoreszcens reagensekkel történő oszlop előtti származékképzést és a származékok fordított fázisú kromatográfiáját (RPC). E módszereknél a kimutathatóság határa a meghatározni kívánt aminosavaknál igen kicsi, és az analitikai rendszer flexibilitása is rendkívüli előnyöket rejt magában (LINDROTH és MOPPER, 1979; TOPHUI és mtsai, 1981; EINARSSON és mtsai, 1987). így többek között automatikus módszereket fejlesztettek ki az optikailag inaktív o-ftálaldehid/merkaptoetanollal (OPA) az a-aminosavak (SMITH és PANICO, 1985), a 9flurenilmetil kloroformáttal (FMOC-CI) pedig az ocaminosavak és az iminosavak együttes meghatározására (CUNICO és mtsai, 1986; BETNER és FÖLDI, 1988). A királis reagenssel történő származékképzés után lehetőség van a fehérjeépítő aminosavak enantiomerjeinek szétválasztására és meghatározására egyetlen analízis során RPC-vel. Mivel a kromatográfiás elválasztás általában 50-70 percet is igénybe vesz, nagyon fontos, hogy a kidolgozott analitikai módszer teljesen automatikus legyen. Előfeltétel még az egyszerű származékképzési reakció, mely szobahőmérsékleten rövid idő alatt végbemegy. Az optikailag aktiv tiolok és az OPA valamint a meghatározni kívánt aminosavak közti reakciót felhasználták aminosav enantiomerek szétválasztására és meghatározására (ASWAD, 1984; BUCK és KRUMMEN, 1987). A királis 1-(9-fluorenil)etil kloroformát (FLEC) használata az enantiomerek szétválasztására azzal az előnnyel is jár, hogy az nemcsak az a-aminosavakkal, de az iminosavakkal is stabil származékot képez (EINARSSON és mtsai, 1987). Külön említést érdemel a geokronológiában való igen gyakori alkalmazása miatt a D-alloizoleucin analitikája. A hidroxiprolin és a treonin mellett az izoleucin az, amely két aszimmetria centrummal rendelkezik. Az izoleucinból az idők folyamán keletkező D-alloizoleucin - mely az izoleucin diasztereomerje - a rutinszerűen alkalmazott ioncserés aminosav elválasztás során az izoleucin és a metionin között jelenik meg a kromatogrammon, azoktól jól elváló, jól értékelhető csúcsot ad. Az a-helyzetű szénatom racemizációját, a Dalloizoleucin képződését a peptidszintézis folyamán igen behatóan tanulmányozta Bodanszky és Conklin (1967). Vizsgálták többek között a sósavas hidrolízis és a különböző harmadrendű aminők hatását a racemizációra. Nagyon fontos annak ismerete is, hogy a fehérje hidrolízise során történik-e racemizáció, hisz - amenynyiben igen - az a mérési eredményeket meghamisíthatja. Különböző tanulmányok beszámoltak arról, hogy a racemizáció foka a hidrolízis folyamán függ a peptid ill. a fehérje típusától, az aminosav környezetében levő többi aminosavtól, és megállapították, hogy a peptidkötesben lévő aminosavak általában gyorsabban racemízálódnak a szabad aminosavaknál (FRANK és mtsai, 1981; SMITH és REDDY, 1989; LIARDON és LEDERMAN, 1986; LIARDON és FRIEDMAN, 1987). WILTSHIRE (1953) L-glutaminsavat 6 mólos sósavval 24 órán refluxáltatva azt tapasztalta, hogy annak mintegy 3-5%-a átalakul D-glutaminsavvá. Ló mioglobint és marha inzulint hidrolizálva 6,6-4,6 %-ban kapott D-glutaminsavat. MANNING és MOORE (1968) a szabad és a peptidkötesben lévő aminosavak racemizációját vizsgálva megállapították, hogy néhány aminosavnál különbözik a savas hidrolízisnél mért racemizáció attól függően, hogy szabad vagy peptidkötesben lévő aminosavról van szó, és attól függően is, hogy a peptidláncban milyen aminosavak között helyezkedik el a kérdéses aminosav. MANNING (1971) egyértelműen leszögezi, hogy szabad L-aminosavat használva kontrollként nem lehet egyértelműen jelezni a racemizáció fokát, mely a fehérjehidrolízis során fellép. Fentiek ellenére a szabad aminosavak sósavas kezelését a fehérje hidrolízise során fellépő racemizáció becslésére többen alkalmazták a geokronológiában. A szerzők többsége 0,1 és 3,7% közötti racemizációt állapított meg ezekben a kísérletekben a különböző aminosavakra. BADA és PROTSCH (1973) egy mai csont D- és Laszparaginsav arányára 0,07-et kapott savas hidrolízist követve. Felhívják a figyelmet arra, hogy a hidrolízis folyamán bekövetkező racemizációt a kor kiszámításánál feltétlenül figyelembe kell venni, ezzel az értékkel korrigálni kell a kapott D- és L-aminosav arányokat. A különböző szerzők által szabad aminosavakra, illetve fehérjében kötött aminosavakra kapott racemizáció értékeket a 2. és a 3. táblázatban foglaltuk össze.