A Magyar Hidrológiai Társaság XXVI. Országos Vándorgyűlése (Miskolc, 2008. július 2-4.)

4. szekció: VÍZKUTATÁS, VÍZTERMELÉS, VÍZVÉDELEM - Plutzer Judit, dr. Török Tamásné dr., Országos Környezetegészségügyi Intézet: Giardia duodenalis és Cryptosporidium spp. előfordulása ivó- és felszíni vizeinkben valamint annak lehetséges hatása az emberi egészségre - a vízgyűjtő védelmének jelentősége

dehidrogenáz-t kódoló gén 432 bp hosszú fragmentje a szubtípusok meghatározásához. A keletkezett termékek azonosságát gélektroforézissel ellenőriztük.

8. Giardia Assemblage B specifikus Real-time PCR-hez a trifoszfát-izomeráz enzimet kódoló 141 bp hosszú génszakaszt szaporítottuk fel a Power SyBrGreen PCR Master mix és ABI 7300 Real-time PCR készülék felhasználásával. A keletkezett termék azonosságát olvadáspont analízissel ellenőriztük.

9. Restrikciós Fragmenthossz analízist (RFLP) a Cryptosporidium 850 bp hosszú SSU rRNA PCR termékeken végeztünk SspI és MboII restrikciós enzimek felhasználásával, valamint a 432 bp hosszú Giardia GDH PCR termékeken NlaIV és RsaI restrikcós enzimek felhasználásával. A keletkezett termékeket gélelektroforézissel és Agilent Chip DNS analízissel a Bioanalyser 2100 készüléken végeztük a gyártó utasításai szerint.

10. A PCR termékek tisztítását a Qiagen Gel Extraction Kit-tel végeztük a gyártó utasításai szerint.

11. A PCR termékek plazmidba ligálása Promega pGEM-T vektor felhasználásával történt a gyártó utasításai szerint, majd a plazmidot transzformáltuk Escherichia coli DH5a sejtekbe és a sejteket felszaporítottuk.

12. A plazmid izolálása a felszaporított Escherichia coli DH5a sejtekből a Qiagen Plazmid Mini Kit felhasználásával történt a gyártó utasításai szerint.

13. A plazmidba ligált PCR termék szekvenálása plazmid specifikus primerek (T7 és M16) felhasználásával, a PCR termékek közvetlen szekvenálása a PCR primerek felhasználásával BigDye terminator V.3.1 cycle sequencing kittel ABI Prism 3100 szekvenáló berendezésen történt.

14. A szekvencia elemzéséhez és szerkesztéséhez a Chromas programot, a szekvenciák összehasonlításához a ClustalW programot, filogenetikai fák létrehozásához a weboldalt használtuk.

www.clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-e.html

15. Az egyedi illetve reprezentatív szekvenciákat feltöltöttük a génbankba és a génbankból referencia szekvenciákat is felhasználtunk a saját szekvenciák elemzéséhez. (Plutzer et al. 2007a,b, 2008, USEPA 2001)

5. Eredmények és következtetések

5.1. Cryptosporidium és Giardia kimutatása és molekuláris analízise magyarországi nyers, felszíni és szennyvizekben

2004-2007 között 16 nyersvíz mintát gyűjtöttünk molekuláris vizsgálatra a felszíni vízmüveinkből (Duna, Tisza, Keleti Főcsatorna, Lázbérc, Komravölgy, Köszörűvölgy, Hasznos, Csórrét, Mátrafüred, Füzéri Nagy-patak, Bódva folyó Sajóecsegnél és Borsodsziráknál), valamint 20 vízmintát, szintén molekuláris vizsgálatra, olyan felszíni vizekből és szennyvizekből, melyek hatással lehetnek az ivóvíznyerő helyek szennyezettségére, ezek: Balatonba ömlő kisvízfolyások, árkok (balatonfüredi Kéki-patak, keszthelyi Büdös-árok, balatonfűzfői Séd, ábrahámhegyi Burnót-patak, vörösberényi Séd, Keleti -), balatoni szennyvíztisztítók (Zánka, Keszthely, Balatonújlak, Révfülöp), a tassi parti szűrésű kutak felett közvetlenül a Dunába ömlő rácalmási szennyvíz, a dunaújvárosi ivóvízkivétel felett 1 km-re a dunaújvárosi kommunális szennyvíz, budapesti szennyvíz, a szolnoki vízkivétel felett a Tiszába ömlő tiszadorogmai szennyvíz, a lázbérci vízkivételtől 16 km-re, a Bán-patakba (Lázbérc) ömlő szilvásváradi szennyvíz és a sajóecsegi vízkivételtől 10 km-re, a borsodsziráki vízkivételtől 5 km-re a Bódvába ömlő edelényi szennyvíz. Az összesen 36 mintából a protozoon koncentrálás után a minták feléből festés után mikroszkópos azonosítást végeztünk, majd a minták második feléből DNS extrahálás után a 4