A Magyar Hidrológiai Társaság XXVI. Országos Vándorgyűlése (Miskolc, 2008. július 2-4.)
4. szekció: VÍZKUTATÁS, VÍZTERMELÉS, VÍZVÉDELEM - Plutzer Judit, dr. Török Tamásné dr., Országos Környezetegészségügyi Intézet: Giardia duodenalis és Cryptosporidium spp. előfordulása ivó- és felszíni vizeinkben valamint annak lehetséges hatása az emberi egészségre - a vízgyűjtő védelmének jelentősége
UV alkalmazása szükséges. Ezek a technológiák a legtöbb kis vízműnél nem találhatók meg (Medema et al. 2006, Betancourt and Rose 2004). 3. Célkitűzés Ahhoz, hogy a Giardia és Cryptosporidium vízben való jelenlétének jelentőségét felbecsüljük rendszerszemléletre van szükség: a protozoonok vízből való pontos kimutatása mellett szükség van a vízgyűjtő területek védelmére, a víztisztítás optimalizálására és a tisztított ivóvíz védelmére egészen a fogyasztói felhasználásig. Munkánk célja, • hogy bevezessük és rutinszerűen használjuk a modern Cryptosporidium oociszta és Giardia ciszta kimutatási technikákat: a különböző vízkoncentrálási módszereket (Filta- Max szivacsszűrés, membránszűrés és flokkuláció), immunomagnetikus szeparációt (IMS), immunofluorescens tesztet (IFT), polimeráz láncreakciót (PCR), Real-time PCR-t, Restrikciós Fragmenthossz analízist (RFLP) • a PCR termékek szekvencia analízise segítségével meghatározzuk a jelenlevő Giardia és Cryptosporidium fajokat, genotípusokat és szubgenotípusokat, mely alapján megállapíthatjuk, hogy emberre nézve milyen veszélyt jelentenek • a szubgenotípus meghatározással a szennyező forrásokat is nyomon kövessük • a releváns településeken epidemiológiai felmérést végezzünk • kapcsolatot tartsunk a vízművekkel annak érdekében, hogy az esetlegesen felmerülő protozoon szennyeződési problémákat megoldjuk 4. Anyagok és Módszerek 1. A paraziták vízből történő koncentrálásához speciális Filta-Max szivacsszűrést és Millipore illetve Macherey-Nagel membránszűrést használtunk, nagy turbiditású vizek esetén pedig kálcium-karbonátos flokkulációt. A szivacsszűrőből illetve a membránszűrőről az oocisztákat foszfátpufferrel mostuk le. Centrifugálással a mintákat tovább koncentráltuk, végül az (oo)cisztákat immunomagnetikus szeparációval (IMS) választottuk el a törmeléktől. 2. A Giardia ciszták székletből történő dúsításához immunomagnetikus szeparációt alkalmaztunk. 3. A mikroszkópos azonosítás előtt a cisztákat, oocisztákat FITC, DAPI festékekkel festettük. 4. A mikroszkópos vizsgálathoz epifluorescens és differenciál interferencia kontraszt mikroszkópiát használtunk. 5. A Giardia GSA 65 nevű antigén kimutatása székletmintákból a Prospect-T Giardia microplate assay-el történt a gyártó utasításai szerint. 6. A DNS extrahálást Qiagen Stool kittel és Mini kittel végeztük a gyártó utasításai szerint, 10 olvasztási és fagyasztási ciklus beiktatásával az oociszták szétroncsolására. 7. Nested illetve seminested PCR módszert alkalmaztunk mindkét protozoon esetében. A PCR targetjei: a Cryptosporidium SSU rRNA 850 illetve 435 bp hosszú szakaszai a faj és genotípus meghatározáshoz, a Cryptosporidum glikoprotein 60 prekurzor fehérjét kódoló gén 850 bp hosszú szakasza a szubgenotípus meghatározáshoz, illetve a Giardia 18S rRNS 292 bp hosszú szakasza faj és Assemblage meghatározáshoz és a glutamate 3
