Hidrológiai Közlöny, 2016 (96. évfolyam)
2016 / Különszám - Csitári Bianka, Fikó Dezső Róbert, Kovács Erika, Szabó Attila, Jurecska Laura, Mentes Anikó, Táncsics András, Máthé István, Felföldi Tamás: Fenolos vegyületek mikrobiológiai lebontásának vizsgálata természetes és mesterséges környezetekben
Csitári B. és társai: Fenolos vegyületek mikrobiológiai lebontásának vizsgálata természetes és mesterséges környezetekben 27 irányelv veszélyes anyagokra vonatkozó osztályozási rendszere szerint a fenol mérgező (T) és maró (C) anyagnak minősül, lenyelve, belélegezve mérgező. A fenol LD50 értéke 317 mg/kg (patkányra vonatkoztatva), amely érték megadja, hogy az adott vegyületből mekkora meny- nyiség okozza 24 órán belül a kísérleti állatok 50%-ának pusztulását. Az élő szervezetekre gyakorolt toxikus hatása mellett mutagén és karcinogén tulajdonságokkal is rendelkezik (Wang és társai 2014). Ezért kiemelt fontosságú a vegyület élővizekből való eltávolítása. A fenolbontó baktériumok segítségével a szennyvizek fenolos szennyezéseit megszüntethetjük. Számos aerob mikroorganizmus képes hasznosítani a fenolt és vegyüle- teit egyedüli szén- és energiaforrásként. Korábbi kutatások kimutatták, hogy a Pseudomonas, Comamonas, Acidovorax, Alcaligenes, Castellaniella, Acinetobacter, Ottowia, Limnobacter és a Rhodococcus nemzetségek tagjai jó fenolbontó képességűek, nagy részüket mesterséges környezetből (bioreaktorból) izolálták, azonban természetes körülmények között is előfordulhatnak fenolbontó baktériumok (Zhang és társai 2004, Felföldi és társai 2010, Vedler és társai 2013). Kutatásunk során egy hulladéklerakó csurgalékvizét kezelő bioreaktor és egy szennyezett sós tó bakteriális diverzitását vizsgáltuk részletesebben, továbbá bomló növényi szerves anyagokban gazdag vizes élőhelyek baktériumközösségét elemeztük az ott előforduló, természetes úton keletkező fenolvegyületek mennyiségének tükrében. Célunk volt a fenolos vegyületek természetes élőhelyeken lévő előfordulásának és lehetséges lebontó szervezeteinek megismerése, hiszen ezeken az élőhelyeken zajló átalakulási folyamatok kevésbé ismertek még a tudomány számára. Ezzel párhuzamosan különböző fenol-koncentrációjú táplevesek segítségével kísérletesen vizsgáltuk az izolált törzsek fenolbontó képességét, valamint teszteltük a többkomponensű fenol-hidroxiláz egyik alegységét kódoló funkciógén (pheU) jelenlétét - a polimeráz láncreakció módszerét (PCR) alkalmazva - annak érdekében, hogy a potenciálisan fenolbontó baktériumokat azonosíthassuk a törzsgyűjteményben. ANYAG ÉS MÓDSZER Kutatásunk során két fenolos anyagokkal szennyezett helyről és három természetes vizes környezetből vettünk mintát. A mintavételi helyszínek megválasztása során olyan vizeket szerettünk volna vizsgálni, amelyekben feltételezhetően megtalálható a fenol, akár természetes, akár mesterséges módon került is a vízbe. A marosújvári (Románia) szennyezett sós tó egy sóbánya üregének beomlása során keletkezett, elnyelve egy áruházat teljes árukészletével együtt, így az ezekből kioldódó anyagok végett jelen lehetnek fenolos vegyületek. A hulladéklerakó csurgalékvizét kezelő bioreaktor (Székelyudvarhely határában, Románia) pedig a hulladékból származó szennyezés miatt rendelkezhet számottevő fenol koncentrációval. A vizsgált természetes élőhelyek bomló növényi szerves anyagokban gazdag barna vizű tavak voltak, ahol valószínűsíthető volt a természetes úton keletkező fenolos vegyületek jelenléte. A három természetes helyszín különböző környezeti adottságokkal bír: 1.) a Kolon-tó (Izsák határában, Magyarország) egy édesvízi mocsár (Mentes és társai 2016)\ 2.) a Sós-ér (Dunatetétlen határában, Magyarország) a színes szikes tavak közé tartozó tó (Boros és társai 2013), amely lúgos kémhatású vízzel rendelkezik, 3.) a Mohos-tőzegláp legnagyobb lápszeme (Tusnádfürdő közelében, Románia), amelynek vize savas kémhatású (Felföldi és társai 2016). A minták fenol-indexét spektrofotométeres abszor- bancia méréssel határoztuk meg a vonatkozó nemzetközi szabvány (MSZ 1484-1:2009) szerint. A hozzáadott két reagens alfa-amino-antipirin és K-hexaciano-ferrát) szín- változással jelzi a fenol jelenlétét a vizsgált mintában. A mintavételi helyek baktériumközösségének azonosítása a bakteriális riboszóma kis alegységét alkotó RNS-t kódoló gén (16S rRNS) szekvencia elemzése alapján történt (Szabó és társai 2015). Ennek főbb lépései az alábbiak voltak: a közösségi DNS kivonását követően a vizsgálni kívánt DNS szakaszt PCR módszerrel felszaporítottuk, a PCR termékeket a High Pure PCR Cleanup Micro Kit (Roche) segítségével megtisztítottuk, a DNS bázissorrend meghatározást megelőző emulziós PCR-t a Roche GS Junior Titanium emPCR Kit-tel végeztük a gyártó utasításai alapján, végül a piroszekvenálás a Roche GS Junior genetikai analizátorral történt. A törzsek izolálását a bioreaktorból és a marosújvári sós tóból végeztük. A helyszínről gyűjtött mintákból fenolt egyedüli szénforrásként tartalmazó ásványi táplevesben (Zhang és társai 2007) dúsítást végeztünk. A dúsított közösségből R2A táptalajon baktériumtörzseket izoláltunk, amelyeket 16S rRNS gén báziselemzés alapján (a szekvenálás menetét ld. részletesebben Máthé és társai 2014) azonosítottunk az EzTaxon adatbázis alapján (Kim és társai 2014). Az izolált törzsek fenolbontó képességét fenolt különböző koncentrációban (100, 300, 500, 700 és 1000 mg/L) tartalmazó táplevesekkel vizsgáltuk. Elvégeztük továbbá a törzsek fúnkciógén alapú vizsgálatát is, amely során specifikus primerek segítségével (Vedler és társai 2013) a többkomponensű fenol- hidroxiláz enzim egyik alegységét kódoló gén (pheU) jelenlétét PCR módszerrel mutattuk ki. Több esetben a termékek nukleotid szekvenciájának meghatározása is megtörtént (ld. fentebb). A filogenetikai elemzést MEGA6 program segítségével (Tamara és társai 2013) végeztük el, beleértve a legmegfelelőbb nukleotid szubsz- titúciós modell kiválasztásának tesztelését is. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK A fenol-index meghatározásának eredménye az 1. táblázatban látható. A legnagyobb értéket a hulladéklerakó csurgalékvizét kezelő bioreaktor, illetve a természetes élőhelyek közül a Mohos-tőzegláp lápszeme esetében mértük, ez utóbbi magyarázható a bomló növényi anyagok nagy mennyiségének jelenlétével, hiszen a lápszem alján több méteres vastagságban megtalálható az elhaló tőzegmoha. A Kolon-tó és a Sós-ér mintáinak fenoltartalma ezzel szemben elenyésző volt.
