Hidrológiai Közlöny, 2015 (95. évfolyam)
2015 / 5-6. különszám - LVI. Hidrobiológus Napok előadásai
73 Egy asztatikus szikes tó planktonikus mikrobaközösségének taxonómiai és funkcionális genomikai analízise Szabó Attila1, Korponai Kristóf1, Somogyi Boglárka2, Vörös Lajos2, Jurecska Laura1, Márialigeti Károly1, Felföldi Tamás1 'ELTE Mikrobiológiai Tanszék, 1117 Budapest, Pázmány Péter sétány 1/C. ( tamas.felfoldi@gmail.com ) 2MTA Ökológiai Kutatóközpont, Balatoni Limnológiai Intézet, 8237 Tihany, Klebeisberg Kuno u. 3. Kivonat: A Kárpát-medence asztatikus szikes tavai a nagy lebegőanyagtartalom és/vagy az oldott színes szervesanyagtartalom miatt fénylimitáltak. Ennek és sajátos kémiai összetételüknek, valamint nagy tápanyagtartalmuknak köszönhetően világviszonylatban egyedülálló élőhelyeknek tekinthetőek. Jellegzetes fizikai-kémiai karakterisztikájuknak megfelelően a tavakat benépesítő mikrobaközösségek is különlegesek. Az itt élő mikroorganizmusok kapcsolatrendszereinek és a közösségben betöltött szerepük mélyebb megértése érdekében kétféle nagyfelbontású genomikai megközelítéssel vizsgáltuk egy kiszáradás közeli állapotban lévő tó, a szabadszállási Büdös-szék planktonikus közösségét 2012 novemberében. Taxonómiai azonosításukhoz a 16S rRNS gén V3-V4 régiójának bázissorendjét Roche GS Junior DNS szekvenáló berendezésen határoztuk meg. A funkcionális jellemzéshez shotgun analízist végeztünk Ion Torrent PGM genetikai a- nalizátorral. Eredményeink alapján egy taxonómiailag és funkcionálisan is komplex közösség képe rajzolódott ki, amelyben legjelentősebb csoportok a Proteobacteria, Actinobacteria és Bacteroidetes törzsek voltak. Nagy számban képviseltette magát két tenyésztésbe nem vont Acidimicrobiaceae nemzetség, valamint a Gracilimonas, a Belliella, a Hydrogenophaga, a Roseovarius és rokon nemzetségek. A funkcionális metagenomikai elemzés többek között rámutatott arra, hogy az alkalikus környezethez és a kiszáradás közeli állapothoz való számos lehetséges alkalmazkodási mód jelen volt a közösségi génkészletben, valamint arra, hogy a szénforrás hasznosítás szerin-út- vonala kitüntetett jelentőségű ebben a környezetben. Kulcsszavak: 16S rRNS gén, szikes tó, metagenom, Na+/H+ antiporter, újgenerációs DNS szekvenálás, funkcionális genomika. Bevezetés A Kárpát-medence asztatikus szikes tavai nagy turbi- ditásuknak, magas tápanyagtartalmuknak és sajátos kémiai összetételüknek köszönhetően világviszonylatban e- gyedülálló élőhelyeknek tekinthetőek (Boros és mtsai., 2014). Jellegzetes fizikai-kémiai karakterisztikájuknak megfelelően a tavakat benépesítő mikrobaközösségek is különlegesek (Felföldi és mtsai., 2009; Somogyi és mtsai., 2009, 2011; Borsodi és mtsai., 2013). Az itt élő mikroorganizmusok kapcsolatrendszerei és a közösségben betöltött szerepük mélyebb megértése érdekében kétféle nagyfelbontású metagenomikai megközelítéssel vizsgáltuk egy kiszáradás közeli állapotban lévő tó, a szabadszállási Büdös-szék planktonikus közösségét. A baktérium taxonok azonosításához a molekuláris taxonómiában használt, a bakteriális riboszóma kis alegységét alkotó RNS-t kódoló 16S rRNS gén felszaporított szekvenciáit az áteresztőképessége és költség-hatékonysága miatt egyre elterjedtebb új generációs szekve- nálási eljárással határoztuk meg. E megközelítés nemcsak a molekuláris alapon történő taxonazonosításra alkalmas, hanem segítségével a teljes közösség anyagcsere -folyamatairól is képet alkothatunk (Segata és mtsai., 2013). Célunk ezen egyedülálló karakterű környezetben élő mikroorganizmusok taxoneloszlásának, anyagcseréjének, alkalmazkodási lehetőségeinek megismerése volt molekuláris genetikai módszerek segítségével. Anyag és módszer A mintavétel 2012. november 27-én történt a Szabad- szállás melletti Büdös-székből. Az alapvető vízkémiai paramétereket a helyszínen mértük (WTW MultiLine P 8211 multiméterrel), míg az a-klorofill (Wellburn, 1994) és az ammonium-, nitrát-, foszfát- és szulfátionok koncentrációjának (Eaton és mtsai., 2005), valamint a planktonikus pikoalgák mennyiségének meghatározása (Macl- saac és Stockner, 1993) laboratóriumi körülmények között történt. A DNS kivonást 500 pL kiindulási vízmintából Ultra- Clean Soil DNA Isolation Kit-tel (MoBio Laboratories) végeztük a gyártó utasításainak megfelelően azzal a különbséggel, hogy a sejtek feltárása Mixer Mill MM301 (Retsch) sejtmalommal történt 30 Hz-en 2 percen keresztül. A taxonok azonosításához a bakteriális riboszóma kis alegységét alkotó RNS-t kódoló gén (16S rRNS gén) egy körülbelül 450 bp hosszú szakaszát szaporítottuk fel po- limeráz láncreakció segítségével három párhuzamos reakcióban a véletlenszerű hatások minimalizálása végett. A reakcióelegy összetétele a következő volt 20 pL térfogatban: 5x Phusion HF Buffer (Thermo Fisher Scientific), 0,2 mM dNTP (Fermentas), 0,4 pg/pL BSA (Fer- mentas), 0,02 U/pL Phusion High Fidelity DNS polime- ráz enzim (Thermo Fischer), 0,5 pM S-D-Bact-0341-b- S-17 és 0,5 pM S-D-Bact-0785-a-A-21 primer (Klind- worth és mtsai., 2013). A reakció hőprofilja a következő volt: kezdeti denaturáció 98 °C 5 perc; 25 ciklus: denatu- ráció 95 °C 40 másodperc, anneláció 55 °C 2 perc és ex- tenzió 72 °C 1 perc; végső extenzió 72 °C 10 perc. A párhuzamos PCR termékeket egyesítettük, majd High Pure PCR Cleanup Micro Kit (Roche) segítségével tisztítottuk. Koncentrációjuk meghatározása és tisztaságuk ellenőrzése Agilent High Sensitivity DNA Kit-tel történt 2100 Bioanalyzer készüléken (Agilent Technologies). Az egyedi DNS molekulák bázissorrendjének meghatározását GS Junior (Roche) készüléken végeztük a gyártó utasításainak megfelelően. A nyers DNS szekvencia adatok feldolgozását a mothur vl.33 szoftverrel (Schloss és mtsai., 2009), a szekvenciák illesztését a SINA programmal (Pruesse és mtsai., 2012), a taxonok azonosítását pedig az ARB-SILVA referencia adatbázis (Quast és mtsai., 2013) alapján végeztük. A funkcionális elemzéshez a kivont DNS-t Ion Xpress Plus gDNA Fragment Library Preparation Kit (Life Technologies) segítségével ffagmentáltuk, majd a szekve- náláshoz szükséges adaptereket ligáltunk a fragmensek- hez. A termékeket Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter) mágneses gyöngyök segítségével tisztítottuk DynaMag-2 (Invitrogen) mágneses oszlopon. A kívánt hosszúságú fragmenseket 2%-os E-Gel SizeSelect gél és E-Gel Agarose Gel Electrophoresis System segítségével (Life Technologies) szeparáltuk. Az egyes lépesekben
