Hidrológiai Közlöny, 2015 (95. évfolyam)
2015 / 5-6. különszám - LVI. Hidrobiológus Napok előadásai
69 rőn (Maidstone, UK) mechanikailag tisztítottuk. A tisztított vízmintákból a szteroidokat egy Strata C18-E SPE oszlopon (lg/20 mL, 55 pm, 70 Á; GenLab, Budapest) töményítettük. A kalibráló oldathoz a gyári standardokat (DRO [SML0147-10MG], LNG [L0551000] és PRG [P0130-25G], Sigma-Aldrich) ismert koncentrációban 30 %-os (v/v) acetonitrilben oldottuk fel. SPE- töményítés A progesztineket Strata C18-E SPE oszlopon extraháltuk. Az SPE oszlopokat 15 mL metanollal aktiváltuk, majd 20 mL LC-MS minőségű vízzel mostuk. Ezt követően vákuummal az oszlopokon a savanyított vízmintákat átszívtuk, majd ismételten mostuk azokat 20 mL LC-MS minőségű vízzel. Az SPE oszlopról a megkötött szteroidokat 15 mL metanollal eluáltuk. A 15 mL szteroid oldatokat bepároltuk rotációs bepárlóval 40 °C-on, majd oldószer-mentesre koncentráltuk azokat (Eppendorf Concentrator Plus, 30°C, V-AL mód). Végül 50 pL metanolban visszaoldottuk a mintákat. HPLC-MS/MS analízis Az 50 pL mintákból 5-5 pL-t injektáltunk a HPLC- MS rendszerbe (Dionex Ultimate 3000 UHPLC, Q-Exac- tive HRMS, Thermo Fisher Scientific). A folyadékkromatográfiás elválasztás egy 2,6 pm szemcseméretű, 100Á szemcse-átmérőjű 150*2,1 mm-es Kinetex Cl8 oszlopon történt, úgy, hogy az oszlop hőmérsékletét a mérés alatt 40 °C-on tartottuk. A mozgó fázis A (0,01 v/v% hangyasav vízben) és B (0,01 % v/v % hangyasav acetonitrilbe) oldószerekből állt. Az áramlási sebesség 300 pL/perc volt. A mozgófázis az elválasztás első három percében 38 % B oldószert tartalmazott. A harmadik és a tizenkettedik perc között egyenletesen felemeltük 55%-ra a B oldószer arányát majd 0,2 perc alatt visszaállítottuk a kezdeti összetételt, ezután ezzel a 38% B oldószert tartalmazó mozgófázissal mostuk az oszlopot 12,8 percig. Az MS fűthető electrospray ionforrással rendelkezett és a mérés során pozitív módban használtuk. A spray feszültségét 4.0kV-ra, az ionforrás fűtési hőmérsékletét 50 °C-ra, a transzferkapilláris hőmérsékletét 300 °C-ra, míg az S-lencsék frekvenciáját 70-re állítottuk be. A ffagmen- tációk során a következő HCD (Higher-Energy Collisio- nal Induced Dissociation) cella energiát alkalmaztuk: 55 % a DRO, 45 % a PRG és 45 % a LNG esetében. Az adatok elemzését Thermo Xcalibur szoftverrel végeztük (2.2 SP1.48-es verzió). A mennyiségi kiértékeléshez kalibrációs görbéket vettünk fel a 0,1 - 20 ng/L-ig terjedő koncentráció tartományban. Ezek jó linearitást mutattak, a korrelációs e- gyütthatóik (R2) 0,95 felett voltak. A mérés kimutatási határa (level of detection, LÓD) 0,01 (DRO), 0,01 (LNG) és 0,003 (PRG) ng/L volt, míg a mennyiségi kiértékelés alsó határa (level of quantification, LOQ) 0,11, 0,09 és 0,03 ng/L volt. Visszanyerési vizsgálatot is végeztünk, melynek során 100-100 pg standardbői az extrakciót és a folyadékkromatográfiás elválasztást a mintákkal mindenben egyező módon elvégezve 76 % (DRO), 81 % (LNG) és 95 % (PRG) hormont mértünk vissza. 1. ábra - A kijelölt 53 mintagyüjtési pont a Balaton és a Zala vízgyűjtő területén. Eredmények és értékelésük Analitikai módszerünk segítségével kimutattuk és mennyiségileg meghatároztuk a DRO, LNG és PRG hormonokat a vízgyűjtőről származó nyers mintákban. A progestinek kimutatása három alapvető analitikai paraméterük alapján történt: a) az adott hormon retenciós ideje, b) az adott hormonra jellemző prekurzor ion ([M+H]+) egzakt molekula tömege és c) az adott hormonra jellemző bomlástermék (fragmensek, [F+H]+) profilja. Mindhárom paraméter együttesen volt feltétele annak, hogy az egyes hormonok létét elfogadjuk a nyers vízmintákban. A DRO retenciós ideje 5,2 percnél, a LNG-é 5,7 percnél, mig a P- RG retenciós ideje 9,8 percnél volt mérhető, mind a standard, mind pedig a nyers minták esetében (2. ábra). 100-n 80V 0s >s öö ez 0 60c 0 > 40"cd 0 Q1 2000 Progesterone: 9.8 min Levortorgestrel: 5.7 min Drospirenone: 5.2 min 5 t (min) 2. ábra - A DRO, LNG és PRO prekurzor ionjainak egymásra másolt kromatogramja ún. “single ion monitor” (SÍM) módban mérve. A függőleges tengelyen a relatív intenzitás %-ban, míg a vízszintes tengelyen a retenciós idők láthatók percben. Analitikai méréseink során az azonosításhoz a következő prekurzor ion - ífagmens átmeneteket ([M+H]+0 —>[F+H]+) monitoroztuk töltés/tömeg (m/z) mértékegységben: DRO 367.23—>97.07 (3. ábra A, B), LNG 313.21—>109.06 és 245.19 (3. ábra C, D), valamint PRG 315.23—>97.07 és 109.06 (3. ábra E, F).
