Hidrológiai Közlöny, 2015 (95. évfolyam)

2015 / 5-6. különszám - LVI. Hidrobiológus Napok előadásai

19

Hagyományostól eltérő eljárások alkalmazása új baktériumtörzsek laboratóriumi tenyésztése érdekében

Felföldi Tamás1’2, Kovács Erika1, Fikó Dezső Róbert1, Tankó György1, Szabó Attila2, Nagymáté Zsuzsanna2, Szilveszter Szabolcs1 és Máthé István1

1 Sapientia EMTE Biomérnöki Tanszék, Ro-530104 Csíkszereda, Szabadság tér 1. (

tamas.felfoldi@gmail.com

) 2ELTE Mikrobiológiai Tanszék, 1117 Budapest, Pázmány Péter stny. 1/c.

Kivonat: A baktériumok túlnyomó többsége esetében nem állnak rendelkezésre laboratóriumi tenyészetek, az eddig még nem tenyésztett mikroszervezetek jelentős része azonban elméletileg tenyésztésbe vonható akár olcsó és egyszerű módszerekkel is. Három nagyon eltérő vizes környezetből kíséreltük meg a baktériumok tenyészthetőségét növelni egyrészt in situ tenyésztés alkalmazásával, másrészt speciális szilardítóa- nyag (gellángumi) és egyedi tápközegek felhasználásával (ez utóbbinál a mintavételi környezetnek megfelelő pH, sókoncentráció és tápanyagtartalom biztosítására ügyeltünk), továbbá hosszú inkubációs idővel a lassan növő baktériumok elszaporodásának adtunk lehetőséget. A közösségek taxonómiai összetételét feltáró tenyésztéstől független vizsgálatainkkal kimutattuk, hogy még a természeteshez hasonló környezetekben történő inkubáció is nagyon erős szelekciós nyomást jelent a baktériumok számára. Mindezek mellett azonban sikerült több, főként a Proteobacteria és Bacteriodetes phylumokba tartozó, potenciálisan új nemzetség és faj tiszta tenyészetét létrehozni, igazolva ezáltal az alkalmazott hagyományostól eltérő módszerek hatékonyságát. Eredményeinkből kitűnik, hogy a tenyésztési hatékonyságot nemcsak a táptalaj összetétele, hanem az alkalmazott szilárdtó anyag típusa és az inkubációs körülmények is döntően meghatározzák.

Kulcsszavak: baktériumok tenyésztése, táptalaj fejlesztés, gellángumi, „baktériumcsapdák”, piroszekvenálás, új taxonok.

Bevezetés

Már több évtizede ismert tény, hogy a környezetünkben élő mikroorganizmusoknak csak egy csekély hányada vonható tenyésztésbe laboratóriumi körülmények között (Staley és Konopka, 1985). A legoptimistább becslések szerint is a Földünkön élő baktériumfajoknak csupán 1-10 %-a áll jelenleg rendelkezésre laboratóriumi tenyészetek formájában, míg talán a valósághoz sokkal közelebb állnak a 0,1 % és 0,001 % közötti, vagy akár ezek a- latti értékek a leírt fajok arányára vonatkozólag (Over- mann, 2013). A „tenyészthetetlenség” nyilvánvalóan abból adódik, hogy laboratóriumi körülmények között nem sikerül biztosítani a baktériumok növekedéséhez szükséges feltételeket. Ennek okai meglehetősen összetettek lehetnek, amik között szerepel a tenyészközeg összetétele (tápanyagok koncentrációja, pH, stb.), az inkubációs körülmények (hőmérséklet, inkubációs idő, oxigén koncentráció, stb.), a tenyésztést megelőzően esetlegesen alkalmazott mintakezelések (szűrés, dúsítás, stb.) és persze a vizsgált minta típusa (fajok közötti biológiai kapcsolatok, mátrix hatás, stb.) (Alain és Querellou, 2009; Varto- ukian és mtsai., 2010). Az eddig nem tenyésztett fajok tenyésztésbe vonására alkalmazott stratégiák pedig általában a következők: (1) nagyon kis tápanyagtartalmú táptalajok használata, (2) hosszú inkubációs idő, (3) speciális anyagokat (pl. növekedési faktorokat, szignálmolekulákat) tartalmazó táp közegek alkalmazása, (4) sejtkivonatok vagy ún. „helper” törzsek használata, (5) különböző in situ tenyésztési módszerek (diffúziós kamrák, „baktériumcsapdák”) alkalmazása, (6) egyedi sejtek polimer anyagba zárása, stb. (Bollmann és mtsai., 2007; Var- toukian és mtsai., 2010; Puspita és mtsai., 2012; Kéki és mtsai., 2013).

Célul tűztük ki ezért olyan - viszonylag könnyen és olcsón kivitelezhető - tenyésztési technikák alkalmazását, amelyek segítségével a különböző környezetekben e- lőforduló baktériumok a lehető legszélésebb körben tenyészthetők, beleértve ebbe új, eddig nem tenyésztett fajok laboratóriumi izolátumainak létrehozását is. A vizsgálat megtervezésénél az alábbiakat követtük: (1) az általánosan használtaktól eltérő táptalaj alkalmazása, ami jelentett részben (i) az általánosan használt táptalajokhoz képest alacsonyabb szervesanyag-tartalmat, (ii) az élőhely néhány főbb fizikokémiai jellemzőjének tükrözését

a táptalajokban (pH, sótartalom, tápanyagtartalom), valamint (iii) az agártól eltérő szilárdító anyagot. Ezen túlmenően (2) hosszú inkubációs időt és (3) in situ tenyész- téses módszert („baktériumcsapdákat”) is alkalmaztunk. Mivel a tenyésztés során nem oxigénmentes környezetben inkubáltuk a mintáinkat és a táptalajaink szerves szénforrásokat tartalmaztak, ezért az már a kísérlet megkezdése előtt sejthető volt, hogy a mintákban megtalálható baktériumoknak csak egy részét, az aerob heterotróf baktériumokat vonhatjuk tenyésztésbe munkánk során.

Anyag és módszer

Mintáink Románia három helyszínéről származtak: a Mohos tőzegmohaláp egyik lápszeméből (Hargita megye), 2010-ben a korábbi marosújvári sóbánya egyik üregének beomlása következtében keletkezett sós tóból (Fehér megye) és Székelyudvarhely és környékének szemét- lerakó helyéről (Cekend, Hargita megye), az elfolyó csurgalékvizet kezelő bioreaktorból. A „bacteriumcsap- dák” kihelyezésére és a mintavételekre 0,4 m mélységből 2013. június 18-20. között került sor.

Három különböző tápközeget készítettünk a mintavételi helyeknek megfelelően (M - Mohos, U - Marosújvár, C - Cekend), mindegyiknek az alapját az R2 médium (DSMZ medium 830, www.dsmz.de

) képezte, amihez még 1,33 g/L CaCl2-ot adtunk (mR2). A tápközegek összetétele a következő volt: M: 50 mL mR2 kiegészítve 1 L-re desztillált vízzel, pH 4,0; U: 50 mL mR2, 50 g NaCl kiegészítve 1 L-re desztillált vízzel, pH 8,0; C: 360 mL mR2, 1,81 g NH4C1 kiegészítve 1 L-re desztillált vízzel, pH 8,0. A szilárdítás mindhárom esetben kétféleképpen 20 g/L agar (A), illetve 10 g/L gellángumi (G, Gel- zan™ CM, Sigma) hozzáadásával történt, így végül mintavételi helyenként kétféle táptalajt alkalmaztunk (Mohos - MA, MG; Marosújvár - UA, UG; Cekend - CA, CG). Minden táptalaj típust kétféle mintavételezési stratégiával kombináltunk. Egyrészt a vízmintából hígítási sor készítését követően szélesztést végeztünk, másrészről pedig egy kb. 2x2x1 cm-es poliuretán hab kockát vontunk be a táptalajokkal (Yasumoto-Hirose és mtsai.,

2006), amiket 1 hónapig inkubáltunk a mintavételi helyeken 0,4 m-es mélységben (1. ábra). A „bacterium- csapdákon” megtapadt baktériumokat szintén hígítási sor és szélesztés segítségével vittük a megfelelő táptalajok felszínére, valamint a blokkok felszínéről oltókaccsal le-