Hidrológiai Közlöny, 2015 (95. évfolyam)
2015 / 5-6. különszám - LVI. Hidrobiológus Napok előadásai
12 A balatoni busák béltartalmában és a tóvízben előforduló baktériumközösségek mennyiségi viszonyainak és szerkezetének összehasonlítása Borsodi Andrea1, Krett Gergely1, László Kristóf1, Jáger Katalin1, Mozsár Attila2, Vitái Zoltán2, Specziár András2, Boros Gergely2 1ELTE Mikrobiológiai Tanszék, 1117 Budapest, Pázmány Péter sétány 1/C 2MTA ÖK Balatoni Limnológiai Intézet, 8237 Tihany, Klebelsberg Kuno utca 3 Kivonat: A Balatonban élő busák táplálkozási szokásainak megismerésére irányuló kutatások keretében 2011-ben kezdődtek bakteriológiai vizsgálatok az állatok béltartalmában található baktériumközösségek feltérképezésére. E vizsgálatok folytatásaként 2013-ban tavasztól őszig 5 alkalommal történt mintavétel hibrid jellegű busa egyedek elő- és utóbeléből, valamint a Balaton vizéből. A mintákból tenyésztésen alapuló módszerrel csíraszám becslést végeztünk. A baktériumközösségek genomi szerkezetét a 16S rRNS génszakaszok denaturáló gradiens gélelektroforézissel (DGGE) nyert sávmintázatainak elemzésével hasonlítottuk össze. Eredményeink alapján a vízmintákból tenyésztéssel meghatározott átlagos baktérium csíraszám értékek közel egy nagyságrenddel kisebbek voltak, mint a busa bélszakaszokból detektált értékek. A DGGE mintázatok alapján valamennyi mintavételi időpontban a vízminták baktériumközösségei mutatták egymással a legnagyobb hasonlóságot, és minden esetben elkülönültek a busa béltartalom minták baktériumközösségeitől. Az egyes busa egyedek előbél és utóbél szakaszából származó minták baktériumközösségei egymástól többnyire szintén jól elkülönülő csoportokat képeztek. A busa egyedek neme vagy testmérete és a tápcsatorna szakaszok baktériumközösségeinek szerkezete között nem találtunk összefüggést. Kulcsszavak: busa, bélmikrobióta, diverzitás, DGGE. Bevezetés A Balatonban élő hibrid (fehér busa - Hypophthalmi- chthys molitrix x pettyes busa - H. nobilis) dominanciájú busaállomány táplálékbázisát elsősorban zooplankton és detritusz képezi. A balatoni busák táplálkozási szokásaira jellemző, hogy nagy mennyiségű szervetlen lebegő a- nyagot is fogyasztanak, melynek száraz tömegre vonatkoztatott részaránya esetenként a béltartalom 80 %-át is elérheti (Vitái és mtsai, 2014). A busák táplálkozásában emellett az egyes bélszakaszokban előforduló faj gazdag és változatos anyagcsere tulajdonságokkal rendelkező baktériumközösségeknek is jelentős szerepe lehet, amire a 2011-ben tenyésztésen alapuló és tenyésztéstől független mikrobiológiai módszerekkel végzett kutatási eredmények is rámutattak (László és mtsai, 2014). Jelen összehasonlító vizsgálatunk célja az volt, hogy tavasztól őszig nyomon kövessük a balatoni busák elő- és utóbél szakaszaira, valamint a tó vízre jellemző baktériumközösségek mennyiségi viszonyainak és genetikai sokféleségének alakulását. Vizsgálati anyagok és módszerek A bakteriológiai vizsgálatokhoz a Balatonból 2013 á- prilisában (1304), májusában (1305), júniusában (1306), szeptemberében (1309) és októberében (1310) méret- szelektív kopoltyúháló fogásból véletlenszerűen gyűjtött busa egyedekből steril körülmények között preparált elő- és utóbél tartalmat, valamint az egyidejűleg merítéssel vett tóvíz mintát használtuk fel. A vizsgálatba vont összesen 34 hibrid jellegű busa e- gyed testhossza 91 és 119 cm, testtömege 11,2 és 25,1 kg, életkora 8 és 13 év között változott. A tenyésztésen alapuló csíraszám becsléshez a béltartalom és a vízminták felhasználásával készített tízes léptékű hígítási sorozatokból nutrient (DSM-1) és R2A (DSM-830) táptalajokra ( www.dsmz.de ) szélesztettünk, majd a kifejlődött telepeket a 22°C-on végzett két hetes inkubációt követően számoltuk meg. A baktériumközösségek genetikai diverzitásának ösz- szehasonlításához egy tenyésztéstől független, molekuláris biológiai ujjlenyomat módszert, a Denaturáló Gradiens Gél Elektroforézist (DGGE) alkalmaztuk (Muyzer és Smalla, 1998). A kb. 500 mg-nyi béltartalomból és a szűréssel tömörített vízmintákból izolált teljes genomi DNS-ből először Bacteria specifikus primer pár (27F és 140ÍR) segítségével a 16S riboszomális RNS-t kódoló gén egy nagyobb szakaszát szaporítottuk fel. Az így kapott DNS szakaszokból egy következő PCR reakció során 27F-GC és 519R, illetve a ciano-baktériumok esetében CYA359F-GC és CYA781R primer pár felhasználásával hoztuk létre a DGGE futtatáshoz használt GC-ka- poccsal rendelkező, kb. 400-500 bázispár hosszúságú terméket. Az elektroforetikus futtatásokhoz 40-60 % közötti denaturáló koncentrációjú ureát és formamidot tartalmazó 7 %-os, illetve a cianobaktériumok esetében 8 %-os poliakrilamid gélt használtunk. A minták futtatása INGENY phor U készülékben 1%-os TAE pufferben 60° C-on, 120 V feszültség értéken 14-15 órán át tartott. A kialakult sávmintázatot etídium-bromidos festéssel, UV gerjesztéssel tettük láthatóvá, majd TotalLab (TL 120) v2006 szoftverrel értékeltük ki. A gélből kivágott, tisztított DNS-t a Sanger-féle módszer automatizált változatával szekvenáltuk, majd a kapott bázissorrendeket az NCBI GenBank internetes adatbázis segítségével értékeltük ki. Eredmények és értékelésük Az egyes állatok előbél és utóbél szakaszainak csíraszám értékei a 2011-ben meghatározott átlagos csíraszám értékekhez (László és mtsai, 2014) hasonlók voltak. A busa előbél és utóbél szakaszokból 2013-ban tenyésztéssel közel két nagyságrendnyi átlagos baktérium csíraszám érték (TKE, telepképző egység) különbséget detektáltunk (i. táblázat). A becsült csíraszám értékek maximumát (2,60 x 108 TKE g'1) az áprilisi előbél mintákból nutrient táptalajon, míg a minimumát (4,07 x 106 TKE/g) a májusi utóbél mintákból R2A táptalajon határoztuk meg. A tenyésztéses vizsgálati időpontokban (áprilisban, májusban és szeptemberben) az előbélből átlagosan 2,73 x 108, 1,48 x 108 és 7,13 x 106, míg az utóbélből átlagosan 5,04 x 107, 1,15 x 107 és 1,50 x 107TKE g'1 csíraszám értéket számoltunk. Ennek alapján a busa előbél szakaszokban az átlagos baktérium csíraszám értékek között nagyobb időbeni eltérések mutatkoztak, mint az utóbél szakaszokban. A vízmintákból tenyésztéssel meghatározott átlagos baktérium csíraszám értékek csaknem minden esetben közel egy nagyságrenddel kisebbek voltak, mint a busa bélszakaszokból detektált értékek (/. táblázat). A víz
