Hidrológiai Közlöny, 2013 (93. évfolyam)
2013 / 5-6. különszám - LIV. Hidrobiológus Napok előadásai
41 Természetes vízminta elemzése 2010 augusztusában a Balaton négy medencéjéből gyűjtött vízminták (merített, ~ 40 cm vízmélységből) fikocianin koncentrációját 7’ és ’5’ módszer szerint határoztuk meg és a kapott eredményeket összevetettük a mikroszkóppal meghatározott cianobaktérium biomasszával. A ’3’ és ’5’ módszer hatékonyságát laboratóriumi és természetes körülmények között is vizsgáltuk. Kísérleteink során különböző alga-biomassza és faji összetétellel jellemezhető természetes vizekből (Pátkai-tározó, Zámolyi-tározó, Kis-Balaton Ingói-berek és Balaton Keszthelyi-medence) gyűjtött mintákkal és a fent említett négy cianobaktérium fajjal is dolgoztunk. Biomassza számolás A mintákat Lugol-oldattal tartósítottuk a fitoplankton összetételét és mennyiségét mikroszkóppal határoztuk meg (Utermöhl, 1958). Eredmények és értékelésük 1 2 Extrakciós módszerek összehasonlítása Számos fikocianin extrakciós protokoll létezik az irodalomban, melyek többsége tengeri, egysejtű (coccoid) cianobaktérium fajok fikocianin tartalmának kinyeréséről szólnak. Kísérleteink során az irodalomban található négy extrakciós módszer hatékonyságát hasonlítottuk össze, melynek során a Cylindrospermopsis raciborskii fonalas nitrogénkötő cianobaktérium (kl-ű 575 pg/1, 20-20 ml szűrlet) ugyanazon tiszta tenyészetével dolgoztunk. A fent leírt módszerek közül a forgókéses homogenizáló volt a legkevésbé hatékony (2. ábra); a maximálisan kinyerhető fikocianin tartalom alig 10%-át lehetett ily módon kivonni a sejtekből. A dörzsmozsaras homogenizálás során értük el a legnagyobb fikocianin koncentrációt (3213 pg/1), azonban rendkívül idő- és munkaigényes feltárásnak bizonyult, valamint nehézkes és nem reprodukálható; az egyes párhuzamos extrakciók ciklusai közötti relatív szórások 5 és 73 % között változtak. 3 4 3500 "B) 2800 n. C 2100 5 Ö 1400 700 ill fagyasztátos-olvasztásos ciklusok száma párhuzamos minták száma 2. ábra: Négy extrakciós módszer (’1-4’) hatékonysága a olvasztás módszer, 2) dörzsmozsaras homogenizálás, 3) A fagyasztás-olvasztás módszernél és az ultrahangos homogenizálásnál az extrakciós időt növelve, kezdetben növekvő fikocianin koncentráció figyelhető meg (1. ábra: 1, 3), majd -feltehetően a bomlás következtében- folyamatos csökkenés. A fagyasztás-olvasztás módszernél a kinyerhető fikocianin koncentráció a 2. ciklusban elérte maximumát (’2’ módszer 68 %-a, ~2200 pg/1), majd a következő ciklusoktól folyamatos csökkent. Ez a csökkenés kezdetben néhány tized % volt, ami az 5. ciklusnál már elérte a 15 %-ot. Ebből látható, ha rosszul választjuk meg -pl. irodalmi adatok alapján, (pl.: Sarada és mtsai, 1999)- az extrakciós ciklusok számát, akkor jelentős fikocianin koncentráció csökkenéssel kell számolnunk. Az ultrahangos homogenizálás esetében egy viszonylag nagy időintervallum áll rendelkezésre a maximálisan kinyerhető fikocianin tartalom elérésére. Mindkét módszer könnyen reprodukálható (c.v. = 2,94%), egyszerű és költséghatékony, azonban a fagyasztás-olvasztás módszernél az optimális ciklus számát befolyásolhatja az a- dott víztér biomassza és faji összetétele is. Az ultrahangos homogenizálás 25 %-kal nagyobb mennyiségű fikocianin kinyerését tette lehetővé, mindamellett, hogy a legkevesebb időt vette igénybe. A dörzsmozsaras homogenizálás és az ultrahangos roncsolás hatékonysága közötti különbség 5 % körüli volt, így ez utóbbi reproduextrakciós idő (mp) extrakciós idő (mp) Cylindrospermopsis raciborskii tenyészeténél: 1) fagyasztásultrahangos homogenizálás, 4) forgókéses homogenizálás. A Balatonban dominánsan előforduló négy cianobaktérium faj esetében vizsgáltuk az egyszeri fagyasztás hatását a fikocianin kinyerésére (3. ábra). Downes és Hall (1998) szerint az extrakció hatékonysága az alkalmazott szonikálási időtől és a szonikáló teljesítmény beállításától függ. Kísérleteink során azt tapasztaltuk, hogy ugyanolyan beállítások mellett, a fajok mechanikai hatással szembeni ellenálló képessége is befolyásolja a feltárás idejét. Fajtól függően esetünkben 15-90 mp között változott az optimális roncsolási idő. Kísérleteink során a Cylindrospermopsis raciborskii sejtjeinek összetörése vette igénybe a legtöbb időt, ami ~1000 pg/1 kl-a koncentráció mellett 90 mp volt. Ezt az Aphanizomenon flos-aquae (~500 pg/1-1 k\-a) és az Anabaena spiroides (~800 pg/1-1 ki-a) követte. E két utóbbi esetében kevesebb, mint egy perc elegendő volt a maximális pigment tartalom kinyeréséhez, míg az Aphanizomenon issatschenkoi-nál ez mindössze 15 mp volt (1500 pg/1 ki-a). Ez utóbbi faj volt az egyetlen a vizsgáltak közül, mely fikocianin koncentrációja a fagyasztást követően kevesebb volt az egyszerű szonikáláshoz képest. Ez az eredmény is alátámasztja ezen faj „érzékenységét” mechanikai hatással szemben. A többi vizsgált faj esetében a kombinált módszer 0,1-9 %-al magasabb fikocianin koncentrációt eredményezett. 3. ábra: Az ultrahangos roncsolás (’3 ’ módszer; háromszöggel jelölve) és a kombinált módszer (’5’ módszer; körre! jelölve) összehasonlítása négy cianobaktérium faj esetében: 1) Cylindrospermopsis raciborskii, 2) Anabaena spiroides, 3) Aphanizomenon flos-aquae, 4) Aphanizomenon issatschenkoi.
