Hidrológiai Közlöny, 2013 (93. évfolyam)

2013 / 5-6. különszám - LIV. Hidrobiológus Napok előadásai

40

HIDROLÓGIAI KÖZLÖNY 2013. 93. ÉVF.5-6. SZ.

Fikocianin meghatározási módszerek és alkalmazásuk különböző trofitású víztereken

Horváth Hajnalka1, Kovács W. Attila1, Vörös Lajos1, Zsigmond Eszter2 és Présing Mátyás1 'mTA ŐK BLI, 8237. Tihany, Klebelsberg Kuno u. 3. - 2Babes-Bolyai Tudományegyetem, Kolozsvár, Románia

Kivonat fikocianin, főként a cianobaktériumokban (kékalgák) szintetizálódó fotoszintetikus pigment, melynek mennyiségi meghatározása

alkalmas a cianobatériumok jelenlétének és relatív megoszlásának gyors becslésére. A pontos mennyiségi meghatározásra alkalmas extrakciós módszerek többsége speciális felszereltséget igénylő, drága eljárás. Kísérleteink során -melyekben négy, rutin laboratóriumokban is kivitelezhető módszert hasonlítottunk össze- megállapítottuk, hogy a legelterjedtebb, fagyasztásos- olvasztásos ciklusokon alapuló módszer alacsony alga-biomassza tartományban (< 30 pg/1) bizonytalan és alulbecsülheti a valós értéket. Ezért célunk volt kidolgozni egy fikocianin meghatározáson alapuló gyors és reprodukálható módszert, mely alkalmas oligo-mezotróf tavak fitoplanktonjának cianobaktérium biomassza becslésére (is). Eredményeink szerint egyetlen fagyasztási- olvasztási ciklus ultrahangos roncsolással kiegészítve, 25 %-kal hatékonyabb extrakciót eredményez. E módszer természetes viszonyok közötti kipróbálása során, a Balatonban a fikocianin koncentrációja erős korrelációt mutatott (r* = 0.8018) a mikroszkóppal meghatározott cianobaktérium biomasszával. Eredményeink alátámasztják a módszer alkalmazhatóságát és érzékenységét oligo- és mezotróf vízterek fikocianin alapján való jellemzésére és alkalmazása biztos lehetőséget nyújt pl. a modem távérzékelés módszerének széles trofitási skálán történő értékelésére.

Kulcsszavak: Cylindrospermopsis raciborskii, Aphanizomenon flos-aquae, Anabaena spiroides, fikocianin, extrakciós módszerek.

Bevezetés 2) Dörzsmozsaras homogenizálás: a centrifugált mintát

A fikobiliproteinek a cianobaktériumokra, Rodophyta és néhány Cryptophyta fajra jellemző pigment-protein komplexek, melyekben alapvetően három fikobilin kromofor fordul elő: az alloftkocianin, a fikocianin és esetenként a ftkoe- ritrin (Williams és mtsai, 1980). A fikobilin kromoforok a tilakoid membrán külső felszínén elhelyezkedő szupramole- kuláris komplexekben a ftkobiliszómában találhatók, mint fő fotoszintetikus kisegítő pigmentek (Sidler, 1994). A fikobiliproteinek szintézise csak az algák egy szűk körére jellemző, ezért e pigmentek meghatározásával ezen algák a- dott víztérben való jelenléte becsülhető (Watras és Baker, 1988). A cianobaktériumok előfordulásának a fikocianin meghatározásán alapuló becslése évtizedekre visszamenő, kiterjedt irodalommal rendelkezik: „in situ” fluorimetriás terepi meghatározás, (pl. Seppälä és mtsai, 2007), „in vivo” fluorimetriás meghatározás (Gregor és Marsálek, 2005), távérzékelés (pl. Simis és mtsai, 2005) vagy „in vitro” kémiai extrakcós módszer (Sarada és mtsai, 1999). Azonban ezek többsége drága felszereltséget igénylő és/vagy időigényes eljárás. Ezért célunk volt kidolgozni egy megbízható, gyors és olcsó módszert a fikocianin mennyiségének meghatározására, a cianobaktérium biomassza gyors becslésére.

Anyag és módszer

Alga kultúra és tenyésztési feltételek

Cylindrospermopsis raciborskii (Wolosz.) Seenayya et Subba Raju ACT 9502, Anabaena spiroides (Kleb.) ACT 9607, Aphanizomenon flos-aquae (L.) Ralfs ACT 9605 és Aphanizomenon issatschenkoi (Ussatzew.) Proschkina-Law- renko) ACT 9608 izolált törzsét használtuk a módszerek hatékonyságának összevetése során. Az alga törzseket 24°C- on, 14-10 óra fény-sötét ciklusban, 40 pmol/m2/mp intenzitású fénnyel megvilágítva (fény mérése LI-COR 1400 fénymérőhöz csatlakoztatott 47t kvantum szenzorral (Walz US-SQS/L)), NaN03-mentes BG-11 tápoldaton szaporítottuk (Rippka és mtsai 1979).

Extrakciós módszerek

A fikocianin kinyeréséhez a 15 ml 0,05 M foszfát puffert (pH = 6,8, Na2HP04, KH2P04), Whatman GF/C membrán- szűrőt és BHG HERMLE Z320 centrifugát (4000 rpm/10 perc) használtunk.

1) Fagyasztás-olvasztás módszer (Bennett és Bogorad, 1973): a minták szűrését követően az alga sejtek fikocianin tartalmát 5 párhuzamos fagyasztási-olvasztási ciklusban vontuk ki. A mintákat -20°C-on fagyasztottuk és 9±l°C-on, termosztátban olvasztottuk ki (NESLAB RTE 17).

jégben hűtött dörzsmozsárban homogenizáltuk (~5 percig). Az egyes dörzsölési ciklusokat követően a mintát centrifugáltuk; a felülúszóból meghatároztuk a fikocianin koncentrációját, a visszamaradt extraktumot további ciklusokban újra homogenizáltuk. A ciklusok számát addig növeltük, míg a fikocianin koncentrációja még mérhető volt a felül- úszóban (esetünkben 5 ciklus/3 párhuzamos)

1. ábra:

Az alkalmazott extrakciós módszerek sematikus ábrája.

.3) Ultrahangos homogenizálás (Cole Parmer Instrument Ultrasonic Homogenizer 4710, normal szonikáló fej, 5 teljesítmény kapcsoló álláson és 50 %-os megszakítási ciklussal): a minták szűrését követően az alga sejtjeinek összetöréséhez különböző ideig tartó ultrahangos roncsolást alkalmaztunk (0; 15; 30; 45; 60; 90 és 120 mp/3 párhuzamos).

4) Forgókéses homogenizálás (Polytron Homogenizer PT 10-35; 710 W): a centrifugált mintát különböző ideig tartó homogenizáltuk (0; 15; 30; 45; 60; 90 és 120 mp).

5) Kombinált módszer (’7 'és ’3 ’ módszer kombinálva): a mintát GF/C-n szűrtük, -20°C-on egyszer fagyasztottuk majd termosztátban olvasztottuk. A fikocianin sejtből való kinyeréséhez a mintákat különböző ideig szonikáltuk a 3. pontban leírt beállításoknak megfelelően (0; 15; 30; 45; 60; 90 és 120 mp/3 párhuzamos).

A különböző extrakciós módszereket követően a mintákat szűréssel (kivéve ’2’-módszer esetében centrifugálással) tisztítottuk. A fikocianin mennyiségi meghatározása során a mérésekhez Shimadzu UV-1601 spektrofotométert és Sie- gelman & Kycia (1978) egyenletét használtuk:

C-fikocianin (PC) = (A615 - 0,474 * A652) / 5,34. ahol: A615: a mért abszorbancia 615 nm-en; A652: a mért abszorbancia 652 nm-en egy cm-es küvettában.