Hidrológiai Közlöny 2012 (92. évfolyam)
5-6. szám - LIII. Hidrobiológus Napok: „A hidrobiológia szerepe a víz-stratégiákban” Tihany, 2011. október 5–7.
44 HIDROLÓGIAI KÖZLÖNY 2012. 92. ÉVF. 5-6. SZ. Rejtett genetikai diverzitás a galléros ostorosoknál - a Codosiga botrytis életciklusa, funkcionális ultrastruktúrája és molekuláris leszármazási viszonyai. Kiss Áron Keve', Ács Éva 2, Kiss Keve Tihamér 2, Frank Nitsche' 'University of Cologne, Biocentrum, Department General Ecology, Zülpicher Str. 47/b, 50674, Cologne, Germany 2MTA Duna-kutató Intézet, 2131 Göd, Jávorka S. u. 14. Kivonat: A galléros ostorosok az édesvízi és tengeri plankton közösségek anyagforgalmilag jelentős egysejtű csoportját alkotják. A modern leszármazástani vizsgálatok alapján az állatokhoz legközelebb álló egysejtű csoport, vizsgálatuk kiemelt érdeklődésre tart számot. A Codosiga botrytis a legelsőként leírt galléros ostoros, és édesvizekben az egyik leggyakrabban előforduló faj. A kutatás során 10, a világ különböző helyeiről - köztük több foszszilis, fagyott permafroszt talajból - származó C. botrytis törzs életciklusát, ultrastruktúráját, és molekuláris filogenetikai viszonyait vizsgáltuk. A 18S rDNS gén alapján készített filogenetikai törzsfa szerint a C. botrytis törzsek elkülönült monofiletikus ágat képviselnek a galléros ostorosokon belül. Az egyes törzsek közti genetikai távolság nagy (3-15% különbség), a morfofaj komplexet 6 kriptikus faj alkotja. A törzsek fenotípusos tulajdonságai meglehetősen hasonlóak: hasonló életciklus, általános morfológia és ultrastruktúra jellemző; apró eltérések a magszerkezetben és a ciszták szerkezetében vannak. A morfofaj szélsőségesen polimorf, összetett életciklussal és változatos életformákkal jellemezhető. Vizsgálataink során közel 40 különböző életformát találtunk, melyek nagy része nem csak strukturálisan, de funkcionálisan is különböző. Kulcsszavak: galléros ostoros, Codosiga botrytis, filogenetika, kriptikus faj, metazoa.. Bevezetés A galléros ostorosok (choanoflagelláták) a heterotróf ostorosok egy igen régóta ismert, egységes sejtszerkezetü és egységes leszármazási eredetű csoportja. Jellegzetességük az egyetlen hosszú ophistokont ostor, és az azt körülölelő, mikrobolyhokból álló gallér. A környezeti mintákban gyakran előforduló, nagy egyedszámokat elérő, kozmopolita csoport, mely elsősorban a tengeri és az édesvízi plankton anyagforgalmában játszik fontos szerepet. Gallétjuk segítségével egyedülálló táplálkozásökológiai niche-t töltenek be a vizekben: a mikrobolyhokból álló koszorúra a legkisebb szerves részecskék is fel tudnak tapadni, így a többi élőlény számára nehezen felvehető ultramikrobaktérium - vírus kolloidális szerves anyag mérettartományban is képesek legelni. A többsejtű állatokkal való szoros rokonságukat a szivacsok űrbelének galléros ostoros sejtjei alapján már régóta feltételezték (Dujardin, 1841); a metazoa-choanoflagelláta testvérkapcsolatot a molekuláris filogenetikai vizsgálatok is megerősítették (King és mtsai, 2009). Az elsőként leírt galléros ostoros faj a Codosiga botrytis (Ehrenberg, 1838) Kent, 1880. Ez az egyik leggyakrabban előforduló édesvízi faj, de tengerben, brakkvízben és talajokban is megtalálható. Anyagforgalmi szerepe jelentős lehet; a Duna planktonjában a tavasz végi - koranyári időszakban a legnagyobb biomasszát elérő heterotróf ostoros (Kiss és mtsai, 2009). A Codosiga nem filogenetikai helye a galléros ostorosokon belül ezidáig ismeretlen. Említésre méltó, hogy a galléros ostorosok magyarországi kutatásának komoly hagyományai vannak: id. Entz Géza (1883) dolgozata és Francé Rezső (1897) galléros ostoros monográfiája a mai napig nemzetközi szinten is idézett müvek. A jelen dolgozat során 10 Codosiga botrytis törzset izoláltunk a világ különböző helyeiről, köztük 5 modernkori, és 5 fagyott permafroszt talajból származó fosszilis törzset. Vizsgálatunkban a következő kérdésekre kerestük a választ: Hol helyezkedik el a Codosiga botrytis a gallérok ostorosok törzsfáján? Mekkora a törzsek közti genetikai variabilitás? Felismerhetők-e biogeográfiai mintázatok, különböznek-e a fosszilis törzsek a modern koriaktól? Milyen fenotípusos különbségek vannak a törzsek között ultrastrukturális, életciklusbeli ill. autökológiai szempontból? Anyag és módszer A törzseket a következő helyekről izoláltuk: Fosszilis törzsek (A1-A5): fosszilis szibériai permafroszt talaj (28-32 ezer éves). Modernkori törzsek: Ml — szibériai talaj, M2 - marokkói talaj, M3 - Montevideo, brakkvíz, M4 - Rajna folyó, Németország, édesvíz, M5 - Grönland, édesvíz. A klóntenyészeteket mikromanipulátor segítségével történő átoltással hoztuk létre. A filogenetikai elemzéshez mind a 10 törzs 18S rDNS génjének teljes szekvenciáját meghatároztuk, ill. az 5 modem kori törzs esetén (M1-M5) a 18S gén mellett a 28S rDNS, a Hsp90 és az •-tubulin gének bázissorrendjét is meghatároztuk. A 18S rDNS és a konkatenát multigén törzsfa készítése maximum likelyhood ill. Bayes-i modellel történt. A szekvencia meghatározás, ill. a filogenetikai analízis részletei Quintela-Alonso és mtsai (2011) munkájában megtalálhatók. A törzsek morfológiai és ultrastrukturális vizsgálata áteső megvilágítású szuper-felbontású fénymikroszkóppal történt, videofelvételek készítésével és elemzésével. A módszer részletesebb ismertetése Brabender és mtsai (2012) munkájában olvasható. Eredmények Leszármazási kapcsolatok A 18S rDNS gén szekvenciája alapján készített törzsfán a Codosiga törzsek egyetlen monofiletikus kládot alkotnak, 100/1,00 ML/ Bayes-i bootstrap értékekkel. A klád az édesvízi, nagyobbrészt háznélküli galléros ostoros szekvenciák csoportjában van (Monosiga, Desmarella törzsek, Salpingoeca amphoridium), egyelőre bizonytalan helyen. A genetikai különbség a legközelebbi nemektől -40%-os. A Codosiga kládon belül is igen nagy genetikai távolságok észlelhetők (3-15 % különbség), melyből kriptikus fajok meglétére következtethetünk. A morfofaj-komplex 6 kriptikus filogenetikai fajra bontható. A típusfaj neotipizálása mellett 5 új faj leírására kerül sor, ezek leszármazási viszonyai a következők: A Codosiga fossila (Al és A4 törzsek, megegyező szekvencia) mintegy 3% távolságra található a Codosiga Siberia (Ml) fajtól, egy kládot alkotva. Az előző klád testvérkládját a szintén kis genetikai távolságokkal (3%) elkülönülő Codosiga gharaba (M2) és a minimális intraspecifikus különbségeket mutató Codosiga akureyii (A2, A3, A5, M5) alkotja. A fenti két nagyobb klád külcsoportját a Codosiga estuarii (M3) törzs adja bő 10%-os szekvencia különbséggel, míg mindezen kládok külcsoportját képezi az új Codosiga botrytis típustörzs, mintegy 15%-os távolsággal. A leszármazástani kapcsolatok nem tükröznek semmilyen nyilvánvaló filogeográfiai mintázatot. A fosszilis törzsek nem különböznek szignifikánsan a modem koriaktól (lásd Codosiga akureyii). A konkatenát multigén törzsfa megerősíti a 18S rDNS alapján készített törzsfa eredményeit: Az öt modernkori Codosiga törzs egyetlen monofiletikus kládon helyezkedik el, édesvízi háznélküli galléros ostoros genusok a legközelebbi rokonok. A Codosiga törzsek és a legközelebbi genusok között 70-80%-os szekvencia különbség van a 4 génben, míg a vizsgálatban külcsoportnak használt metazoákon belül csak 30-40%-os a különbség. Fenotípusos tulajdonságok Az igen részletes és nagyfelbontású mikroszkópos vizsgálattal sikerült feltárni a Codosiga botrytis morfofaj-komplex életciklusát (1. ábra). A klasszikusan C. botrytis-ként ismert nyélen ülő, trophozoitcsokrot tartalmazó kolónia az