Hidrológiai Közlöny 2012 (92. évfolyam)

5-6. szám - LIII. Hidrobiológus Napok: „A hidrobiológia szerepe a víz-stratégiákban” Tihany, 2011. október 5–7.

38 HIDROLÓGIAI KÖZLÖNY 2012. 92. ÉVF. 5-6. SZ. Vörös-tó A Medve-tó mikrobaközösségeinek vizsgálata molekuláris módszerekkel Hegyi Anna

1, Felföldi Tamás

1, Máthé István

2, Palatinszky Márton

1, Jurecska Laura

3, Barkács Katalin'-Márialigeti Károly

1 'Eötvös Loránd Tud. egyetem, Mikrobiológiai Tanszék, 1117. Bpest, Pázmány P. sétány 1/c. (tamas.felfoldifffigmail.co

m) 2Sapientia Erdélyi Magyar Tudományegyetem, Biomérnöki Tanszék, Ro-530104 Csíkszereda, Szabadság tér 1., Románia 3Eötvös Loránd Tud. egyetem, Környezettudományi Kooperációs Kutatóközpont, 1117. Budapest, Pázmány P. sétány l/a. Kivonat: A szovátai Medve-tó Románia egyik legnagyobb sós tava. Érdekessége a heliotermia jelensége: a tavat legfelül édesviz borítja, amely átengedi a napsugarakat, és ezzel lehetővé teszi az alatta található sós víz felmelegedését és a tó hőmérsékleti rétegződését. A különböző sótartalmú vízrétegeknek köszönhetően 2,5-3 méter mélységben a fizikai és kémiai paraméterek ugrásszerűen megváltoznak, és ebben a zónában megfigyelhető egy „zöld" réteg is fototróf szervezetekkel. Vizsgálatunk célja a tóban élő mikrobaközösségek (Bacteria, Archaea és Eukarya) tér- és időbeli mintázatának összehasonlítása volt. A különböző vízrétegek közül a zöld váltóréteg közösségi szerkezetét részletesebben vizsgáltuk. A riboszomális RNS kis alegységét kódoló gén felszaporítását követően denaturáló gradiens gélelektroforézist (DGGE) alkalmaztunk, amit a domináns genotípusok azonosítása követett a gél kivágott sávjaiból. Jelentős tér- és időbeli heterogenitást tapasztaltunk, különösen a Bacteria csoportba tartozó közösség esetében. A zöld rétegből a Picochlorum oklahomensis (pikoeukarióta zöldalga), és a Prosthecochloris vibrioformis (zöld kénbaktérium) fototróf fajokat azonosítottuk. Kulcsszavak: Medve-tó, fototróf szervezetek, 16S és 18S riboszomális RNS gén, DGGE Bevezetés A Medve-tó 1875-1880 között a szovátai só-karszton (Románia) jött létre egy beomlott dolina helyén, amelyet a környező patakok feltöltöttek. A világ egyik legnagyobb heliotermikus tavaként egyedi só- és hőmérsékleti rétegeződéssel bír. A befolyó Aranyos- és Toplica-patak, illetve a csapadék hatására a tó felszínén egy 8-12 cm vastag édesvíz réteg alakult ki. Ez átengedve a napfényt elősegíti az alatta található sós víz felmelegedését. A felszíni édesvíz kis sűrűsége miatt nem keveredik a felmelegedő sós vízzel, és felette hőszigetelő réteget képez. Ennek köszönhetően a Medvetóban az év jelentős részében paradox hőmérsékleti rétegződés alakul ki: (1) a felszíntől 1,5-3,5 méterig egy hőmérséklet növekedéssel járó indirekt rétegződés, (2) majd innentől a vízfenékig egy hőmérséklet csökkenéssel járó direkt rétegződésjelenik meg (Alexe és mtsai, 2006). A Medve-tó egyedi rétegződése, a mélységgel változó fiziko-kémiai körülményei miatt változatos életteret nyújt a benne élő mikroszervezetek számára (Alexe és mtsai, 2006). A tó sótartalmának és hőmérsékleti rétegződésének vizsgálata a 19. század végére nyúlik vissza (Lengyel, 1898, Kalecsinszky, 1901). Később élő szervezetekre (fitoplankton, makrofitbentosz, makrofiton és Zooplankton) irányuló kutatások is folytak (Bulgáreanu és mtsai, 1978, Ionescu és mtsai, 1998), de a mikrobaközösségek fajösszetételének részletes felmérésére ezidáig nem került sor. A mikrobiális fajösszetétel kiteijedt vizsgálatához a tenyésztésen és a mikroszkópos megfigyelésen alapuló módszerek mellett elengedhetetlen a molekuláris eszköztár alkalmazása. Ennek oka, hogy a molekuláris módszerek lehetővé teszik a tenyésztésbe eddig nem vont, illetve mikroszkóppal nem azonosítható mikroba-csoportok meghatározását is. Munkánk során célul tűztük ki a Medve-tóban élő mikrobák diverzitásának vizsgálatát, a domináns fajok azonosítását molekuláris módszerek segítségével, és a közösségek eloszlásának összevetését az egyes rétegek fiziko-kémiai paramétereivel. Anyag és módszer A különböző vízmélységekből történő mintavétel a tó legmélyebb pontja feletti vízoszlopból (M pont) történt, emellett a 3 méter mély vízrétegből még öt különböző (A-E) ponton vettünk mintát (1. ábra). A helyszíni fiziko-kémiai mérések [fotoszintetikusán aktív fény (PAR), hőmérséklet, oldott oxigén (DO) és klorofill -a] Hydrolab gyártmányú Datasonde 4 mérőműszerrel történtek az M mintavételi ponton. A sótartalmat a 105°C-on tömegállandóságig szárított, majd 600°C-on izzított minta maradékanyag-tartalmából határoztuk meg. Az ammónium, foszfát- és a szulfátion koncentráció mérése fotometriás, míg a szulfidion koncentráció meghatározása jodometriás módszerrel történt (APHA-A WWA-WEF, 2006). üluslános mintavételi hely: 0-15 111 1. ábra. Mintavételi helyek a Medve-tavon A közösségi DNS kivonását a szűrést követően az UltraClean Water DNA Isolation Kit (MoBio Laboratories Inc., USA) segítségével végeztük. Ezt követte a 16S rRNS (Bacteria és Archaea), ill. a 18S rRNS gén (Eukarya esetén) felszaporítása PCR-rel. Ehhez a Bacteria csoport esetén a GC-968F-1401

R primerpárt (Nübel és mtsai, 1996) használtuk. Az Archaea csoportnál kétlépcsős PCR-t alkalmaztunk: az A109F-A934R primerpárral (Baker és mtsai, 2003) kapott termékre, egy újabb reakciót mértünk össze a GCA340F-A934R (Baker és mtsai, 2003) primerpár felhasználásával. Az Eukarya dómén esetén az előbbihez hasonló módon a kétlépcsős PCR során első lépésben az Euk328FEuk329R (Moon-van der Staay és mtsai, 2000) primerpárt, majd a kapott termékre pedig a második lépésben az Eukl AF-GC-Euk516R primerpárt (Diez és mtsai, 2001) használtuk. A DGGE-t 40-70 %-os (Archaea és Bacteria), illetve 20-50 %-os (Eukarya) denaturáló koncentráció mentén végeztük el 8 %-os poliakrilamid gélben. Az elektroforézis INGENYphorU-2 (INGENY International, Hollandia) készülékkel zajlott 100 V-on 60°C-on 15 órán keresztül 1 % -os TAE pufferben. A gélből az egyes sávokat etídium-bromidos festést követően kivágtuk, és a visszanyert DNS-t PCR-rel felszaporítottuk a fent megadott módon. A kapott terméket az EZ-10 Spin Column PCR Product Purification Kit (Bio Basic Inc., Kanada) segítségével megtisztítottuk. A szekvenáló reakciókat BigDye" Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kittel (Applied Biosystems, USA) végeztük el, majd etanolos tisztítást alkalmaztunk. A kapilláris gélelektroforézist a Biomi Kft. (Gödöllő) végezte. A Chromas program (Technelysium Pty Ltd., Ausztrália) segítségével manuálisan javítottuk ki az automatikus leolvasás látható hibáit. A legközelebbi rokon szekvenciákat az NCBI (National Center for Biotechnology Information, USA) honlapján elérhető BLAST (Altschul és mtsai, 1997) és a típustörzseket tartalmazó EzTaxon adatbázis (Chun és mtsai, 2007) segítségével kerestük meg. Eredmények és értékelésük A kémiai eredmények alapján látszik, hogy 2,5-3 méteres mélységben a fiziko-kémiai paraméterek ugrásszerűen megváltoznak (2. ábra): a fotoszintetikusán aktív fény és az