Hidrológiai Közlöny 2010 (90. évfolyam)

6. szám - LI: Hidrobiológus Napok: „Új módszerek és eljárások a hidrobiológiában” Tihany, 2009. szeptember 30–október 2.

57 ktrumból, 4. inverz Fourier-transzformáció (ImageJ), 5. Gauss-i / szigma zajszűrés (pixelsugár: 4, Gauss eloszlás félszélessége: 8), 6. rangszürés (pixelsugár: 3, rangsor: 50 %), 7. differenciális kontraszterősítés (sávszélesség: 30 %, kontraszt: 60%), 8. rangszürés (pixelsugár: 3, rangsor: 50 %), 9. intenzitásnövelés szükség esetén (5-9: Olympus CellD). A zajszürések mellett a legfontosabb lépés a differenciális kontraszterősítés, mely a kép intenzitás hisztogramjának csúcsa körül egy megadott sávban növeli a kontrasztot. A fényes és sötét részek így érintetlenek, csak a DIC-es kép szürke hátterén nőnek meg az apró intenzitáskülönbségek, és válnak jól láthatóvá a sejtalkotók. A kiindulás és az eredmény az lb-c ábrán láthatók. A különböző sejtalkotók mérete az intenzitásprofilok mentén pontosan mérhető. Optikai szeletek felvétele és elemzése a térbeli rekonstrukcióhoz: Az optikai szeleteket az objektív z-irányú mozgatása során (-élességállítás) készített video-felvételekből vágtuk ki. A mikrométercsavar egyenletes állításával az élőlény az aljától a tetejéig végigpásztázható, közben a video számos képkockát rögzít. A módszer nagy előnye, hogy minden eddigi optikai szeletclési eljárásnál gyorsabban elkészíthetők a szeletek, hiszen egyetlen másodperc alatt 25 szelet vehető fel. Ez tette a módszert alkalmassá a mozgó élőlények szerkezetének térbeli rekonstrukciójára. Hátránya, hogy a z-kalibráció pontatlan, mozgó élőlényeknél utólag kell becsülni. A térbeli rekonstrukciót lehetővé tevő programok fluoreszcens felvételekre lettek kidolgozva, ahol az információt a sötét háttéren megjelenő intenzitás erőssége adja. Áteső megvilágítás és DIC használata mellett azonban az információt a szürkétől kissé eltérő, alig sötétebb vagy világosabb foltok jelentik. A DIC-kel készült képeket így a rekonstrukcióhoz át kell alakítani. Az átalakítás egyik módja az erős differenciális kontraszterősítés, melynél a sejtszerkezet hűen megőrződik, azonban a struktúrák kevésbé kiemelkedőek, és a szürke háttér kevésbé átlátszó. Másik lehetőség egy erős pseudo-térhatást adó derivativ filter használata, ahol hangsúlyosabbak a struktúrák, de a vastagságok módosulnak és a sejtalkotók helyzete eltolódhat, így ez mérésekre kevésbé alkalmas. Az általános sejtrekonstrukcióhoz a differenciális kontraszterősítés, egyes struktúrák vizsgálatához (pl. magszerkezet) a derivativ filter tűnik alkalmasabbnak. A differenciális kontraszterősítés lépései hasonlók a képelemzésnél bemutatottakhoz: szürkeárnyalatossá alakítás, Fourier-transzformációs lépések a csíkok eltávolítására, gamma korrekció szükség esetén, szigma szűrés, rang szűrés, differenciális kontraszterősítés (sávszélesség: 30 %, kontraszerősség: 60-80 %). Egy utolsó intenzitás-csökkentő (-10 %) és kontrasztnövelő (+40 %) lépés szükséges lehet. A derivativ, pszeudo-térhatású filter a következő mátrixszal működött a legjobban: 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -2 0 0 0 0 0 0 0 -2 0 0 A mátrix az intenzitás-átmeneteket (ez az információ) teszi láthatóvá. Összehangoltuk az objektumokról bal felső oldalról világos, jobb alsó oldalról sötét képet adó DIC megvilágítással. Nagyobb képméret esetén nagyobb mátrix, kisebb nagyítás esetén kisebb mátrix szükséges, hasonló szimmetriával. Alkalmazása előtt, a zajszűrés után szükséges egy lágyítás (átlagoló szűrő, 3x3 px), alkalmazása után pedig egy rangszürés (pixelsugár: 3). Az intenzitás hisztogram mintavételezési görbéjének újraállítása szükséges lehet: a sötét intenzitásoknál jó, ha a lineárisnál lejjebb fut a görbe, majd a közepes intenzitásoknál meredekebben kezdjen el emelkedni. Az eredmény az //ábrán látható. Térbeli rekonstrukció: A fent leírtak alapján átalakított képsorozatból lehetséges térbeli rekonstrukciót készíteni (Zeiss AxioVision). A rekonstrukcióban minden, a citoplazmánál erősebben fénytörő sejtszervecske jól látható, sőt a citoplazma különböző fluiditású helyei is megjelennek (a szol állapotú részek átlátszóbbak). Mivel az egész sejt nem látható át, érdemes képzeletbeli, tetszőleges irányú szeletenként végighaladni. A megfelelő nézetben a sejt felénk eső része eltűnik, a képzeletbeli metszési sík alatti részbe viszont jó néhány optikai szelet mélységig beleláthatunk. Az így készített ostor alapi test és sejtmag és sejtszerkezet rekonstrukciók az ld le és lg ábrán láthatók. A sejt felületének térbeli alakja is megjeleníthető. Eredmények és értékelésük Lehetséges alkalmazási területek A szerkezetvizsgálatokkal (ide tartoznak a különböző irányokban készített optikai keresztmetszetek és a térbeli rekonstrukció) feltárható az egysejtűek sejtszerkezete, például: a sejtfelszín alakja, az ostorok eredése, az alapi testek, a magszerkezet, a Golgi-apparátus, egyes mikrotubuláris képletek, a mitokondrium, a bekebelező szervecske és az álláb alakja. Az Ih-p. ábrán példákat mutatunk be az alapi testekhez kapcsolódó mikrotubulus gyökerek (Íj), a Golgi-apparátus (In), a mitokondriumok (lo), az extruszómák (lh), a pikkelyek (lm), a sejthüvely (11), a sejtgaratot merevítő mikrotubulusprizmák (lk), illetve a bekebelező szervecske (lp) szerkezetére. A módszer azonban feltehetően jól használható metazoák testszerkezetének feltárására is, különösképpen az összhuzékony, lágy szervek szerkezetének élő állatban való megfigyelésére (pl. kerékszerv). Az időbeli vizsgálatokkal (videofelvételek) tanulmányozható az egysejtűek úszása, mozgásaik, az ostorcsapások, az álláb-képzés, a citoplazma mozgások, a sejtváz módosulásai, az életforma váltás, a táplálékszerzés, stb. Egy kúszó Cercomonas faj ventrális oldalának plazmamembránján keletkező ismeretlen mechanizmusú, önszerveződő hullámok az li ábrán láthatók. Metazoáknál hasonlóképpen vizsgálhatók a mozgások, az úszás, a táplálékfelvétel, a táplálék típusa (bekebelezés előtt!). Öszszességében sok fontos funkcionális, ill. viselkedés-ökológiai tulajdonság vizsgálható közvetlenül, mind természetes, mind kísérletes rendszerekben. Az optikai szeletek felvételének gyorsasága lehetőséget ad lassabban mozgó fajoknál az időben egymást sűrűn követő optikai szeletelésre, ezáltal a szerkezet időbeni változásainak feltárására (4D). Erre egysejtűeknél például az állábképzés, plazmaáramlások, és a bekebelezés vizsgálata során nyilhat lehetőség.