Hidrológiai Közlöny 2010 (90. évfolyam)

6. szám - LI: Hidrobiológus Napok: „Új módszerek és eljárások a hidrobiológiában” Tihany, 2009. szeptember 30–október 2.

58 HIDROLÓGIAI KÖZLÖNY 2010. 90. ÉVF. 6. SZ. A módszer alkalmazásával eddig elért eredmények A módszer lehetővé teszi környezeti mintákban a ritka fajok vizsgálatát, mert akár egyetlen példányról is összegyűjthető az identifikációhoz elegendő strukturális ill. további értékes funkcionális információ. A videomikrográfiás módszert egy természetközeli tenyésztéses eljárással kombinálva, a kisméretű heterotróf egysejtüeknél igen nagy, a korábbi ismereteket jóval meghaladó lokális fajgazdagságot sikerült kimutatnunk a Duna planktonjában (Kiss és mtsai 2008). A rang-abundancia görbék alapján a ritka fajok nagy száma volt kimutatható, mely egybevág a molekuláris ökológiai módszerekkel kapott eredmények alapján felállított 'ritka protista bioszféra' koncepcióval. Ezen feltételezés szerint az egysejtűek lokális és globális diverzitása nagyságrendekkel nagyobb az eddig megfigyelt értékeknél, amit a ritka fajok nagyon nagy száma magyaráz (Stoeck és mtsai 2009). Módszerünkkel a sokáig egységesen bakterivornak tartott heterotróf ostorosoknál számos különböző niche-csoportot és guildet tudtunk megkülönböztetni, összességében meglehetősen nagy funkcionális sokféleséget tártunk fel. A módszer által lehetővé tett nagyfelbontású szerkezetvizsgálatok eredményeképpen több tíz tudományra nézve új ostoros faj is előkerült. A továbbfejlesztés lehetőségei Bár az eredmények eddig is ígéretesek, és az alkalmazási területek még messze kihasználatlanok, a videomikrográfiás technika a továbbfejleszthetőség terén is komoly perspektívákkal rendelkezik. A felbontóképesség növelhető az objektív apertúrájának növelésével (TIRF objektívek), a hullámhossz csökkentésével a mai fénymikroszkópok optikai áteresztéséig (~350nm), illetve jelentős növekedés volna elérhető a DIC irányával párhuzamos, jó minőségű ferde megvilágítás használatával. A kontraszt növelhető analóg kontrasztosítással, további zaj szűréssel és ferde megvilágítással. A videokamera tér és főleg időbeli felbontásának növelése új sebességtartományok nagy térbeli felbontású vizsgálata felé nyitna kaput. Az optikai szeletek mélységélessége csök-kenthető dekonvolúciós eljárással, illetve konfokális feltét alkalmazásával. Teljesen új területek nyílnának meg a vitális fluoreszcens festékek mozgó élőlényeken való alkalmazásával és nagyérzékenységű videokamerás detektálásával. Hasonlóképp kecsegtető a morfológiai és funkcionális jellemzőket feltáró, ritka fajok vizsgálatát is lehetővé tevő fénymikroszkópos módszerek kombinálása a molekuláris filogenetikai módszerekkel, mikromanipulátor és egysejt PCR használatával. Konklúzió Talán a legfontosabb üzenet az eukarióta mikroorganizmusokkal foglalkozó ökológusok számára az lehet, hogy a divatos műszeres és automatizált vizsgálati módszerek mellett az eukarióta mikroszervezetek természetes környezetben való élve megfigyelésének továbbra is komoly létjogosultsága van. A megfigyelésekkel feltételezések helyett közvetlen bizonyítékokat szerezhetünk az élőlények funkcionális jellemzőit és természetben betöltött szerepüket illetően. Módszerünkkel gyakorlatilag minden szabadon élő eukarióta felfedezhető, megfigyelhető, és számos alapvető funkcionális jellemzője feltárható. A molekuláris genetikai módszerekkel kimutatott óriási eukarióta diverzitás és a 'ritka protista bioszféra' az ismertetett új módszerek használatával láthatóvá, megfoghatóvá és vizsgálhatóvá válik. Irodalom Boenigk, J., Arndt, H., 2000. Particle Handling during Interception Feeding by Four Species of Heterotrophic Nanoflagellates. J. Eukaryot. Microbiol. 47: 350-358. Kiss, A. K., Acs, E., Kiss, K. T., 2008. Váratlan heterotróf nanoeukarióta diverzitás a Duna planktonjában. Hidr. Közlöny 89 (in press). Kuehn, M., Hausner, M., Bungartz, H.-J., Wagner, M., Wilderer, P. A., Wuertz, S., 1998. Automated Confocal Laser Scanning Microscopy and Semiautomated Image Processing for Analysis of Biofdms. Appl. Environ. Microbiol. 64: 4115-4127. Porter, K. G., Fieg, Y. S., 1980. The use of DAPI for identifying and counting aquatic microflora. Limnol Oceanogr 25:943-948. Stoeck, T„ Richards, T. A., Bass, D„ Nebel, M., 2009. Exploring the "Rare Protistan Biosphere". 28. Wissenschaftliche Tagung der Deutsche Gesellschaft fur Protozoologie, Naumburg (Saale). Programm & Abstracts, Uinversität Leipzig p. 29 Three dimensional reconstruction of the cell structure of heterotrophic flagellates from transmitted light illuminated light microscopic optical cross sections. A. K. Kiss, É. Acs, K. T. Kiss Hungarian Danube Research Station of H.A.S., 2131, Göd, Jávorka S. u. 14. Abstract: We present a new videomicrography-based technique, by which high resolution and high contrast video records can be made from living and moving microbial eukaryotes. The general three dimensional cell or body structure of the organisms can also be reconstructed. An inverted microscope is used with high numeric aperture objectives and Nomarski DIC contrast. The sample is situated in a microaquarium, the front lens of the condenser is pushed into the water sample. Video records are taken by an analogous CCD camera, its signal is digitalized by an A/D converter, the video is recorded on PC hard disk. Very informative pictures can be obtained by the image analysis of frames that were cut out from the video. Optical cross section series can be obtained by making a video during the z-directional moving of the objective. The transmitted light illuminated and DIC contrasted frames can be modified to be ready for the three dimensional reconstruction by using noise reduction and differential contrast enhancement or by a derivative pseudo-three dimensional filter. After the three dimensional reconstruction, the spatial position of many different cellular structures can be investigated (e.g. the structure of the nucleus, basal bodies and insertion of flagella). Many important structural and functional characters can be observed by the structural and temporal investigations of both protists and metazoa. Keywords: light microscope, video, three dimensional reconstruction, DIC, heterotrophic flagellate.