Hidrológiai Közlöny 2010 (90. évfolyam)

6. szám - LI: Hidrobiológus Napok: „Új módszerek és eljárások a hidrobiológiában” Tihany, 2009. szeptember 30–október 2.

56 HIDROLÓGIAI KÖZLÖNY 2010. 90. ÉVF. 6. SZ. Heterotróf ostorosok sejtszerkezetének térbeli rekonstrukciója áteső megvilágítású fénymikroszkópos optikai szeletekből. Kiss Áron Keve, Ács Éva, Kiss Keve Tihamér MTA ÖBKI Magyar Dunakutató Állomás, 2131. Göd. Jávorka S. u. 14. Kivonat: A jelen dolgozatban egy új video-mikrogáfiás módszert ismertetünk, melynek segítségével élő, mozgó eukarióta mikroorganizmusokról készíthetők nagyfelbontású és nagy kontraszttal rendelkező videofelvételek, és elkészíthető a szervezetek sejt ill. testszerkezetének általános térbeli rekonstrukciója. A módszer nagy numerikus apertúrájú objektívvel ellátott, Nomarski DIC kontrasztosítású fordított mikroszkópot alkalmaz. A minta egy mikroakváriumban található, a kondenzorlencse beleér a vízmintába. Az élőlényekről analóg kamera és külső A/D konverter segítségével digitalizált videofelvételeket készítünk merevlemezre. A videofelvételek elemzésével, képkockák kivágásával és képelemzési eljárásokkal nagyon részletgazdag felvételek kaphatók. Az objektív z-irányú mozgatása közben készített videofelvételekből optikai szeletsorozat nyerhető. Az áteső fényű DIC kontrasztosítású képekből zajszűrés után differencális kontrasztosítással vagy egy derivativ, pseudo-térhatást okozó szűrő használatával a háromdimenziós rekonstrukcióhoz megfelelő optikai szeletek állíthatók elő. A háromdimenziós rekonstrukció után sok különféle sejtalkotó térbeli helyzete megfigyelhető (pl. magszerkezet, ostorok alapi teste). Mind a szerkezetvizsgálatok, mind az időbeli vizsgálatok számos fontos szerkezeti és funkcionális tulajdonság megfigyelésére adnak lehetőséget mind egysejtűeknél, mind metazoáknál. fénymikroszkóp, video, háromdimenziós szerkezet rekonstrukció, DIC, heterotróf ostoros Kulcsszavak: Bevezetés A modern fénymikroszkópos módszerek elterjedése komoly áttörést jelent az utóbbi két évtizedben az élettudományok területén. A két legnagyobb hatású újítást feltehetően a fluoreszcens mikroszkópia és az optikai szeletelő technikák elterjedése jelenti. A fluoreszcens festékekkel specifikusan lehet festeni sejteket, sejtszervecskéket, molekulákat, az optikai szeletekből pedig a modern számítógépes háttér segítségével a struktúrák háromdimenziós rekonstrukciója válik lehetővé. Az eddig elsősorban az élettan, molekuláris biológia és immunológia területén elterjedt módszerek a mikrobiális ökológiában is új területeket nyitnak meg (pl. baktériumok, heterotróf ostorosok számlálása, Porter és Fieg 1980; biofllm szerkezetvizsgálatok konfokális lézer pásztázó mikroszkóppal, Kuehn és mtsai 1998; videomikrográfia használata ostorosok táplálékfelvételének vizsgálatában, Boenigk és Arndt 2000). Ennek ellenére az eukarióta mikrobiológiában és a hidrobiológiái vizsgálatokban csak szórványosan fordulnak elő ezek a gyakran kevéssé ismert, de igen nagy perspektívával rendelkező módszerek. Jelen dolgozat célja egy új módszer bemutatása, mellyel élő eukarióta mikroorganizmusok tanulmányozhatók nagy-felbontású és nagy kontraszttal rendelkező videofelvételek segítségével, és elkészíthető a szervezetek sejt ill. testszerkezetének általános térbeli rekonstrukciója. A háromdimenziós szerkezetrekonstrukció áteső megvilágítású optikai szeletek kombinációjával készül, mellyel az eddigi kizárólagos fluoreszcens megvilágítással szemben - a rekonstrukcióban minden, a citoplazmától eltérő fénytörésü sejtalkotó megjelenik, így az általános sejtszerkezet átfogóan tanulmányozhatóvá válik. További újítást jelent a mozgó sejtek vizsgálatának lehetősége, melynek segítségével sok nagyon fontos funkcionális információ szerezhető a szervezetről. A módszer részletes bemutatásán túl kitérünk a lehetséges alkalmazásokra, az eddig elért eredményekre és a továbbfejlesztési lehetőségekre is. A módszer részletes ismertetése Fénymikroszkóp: A vizsgálatban fordított mikroszkópot használtunk (Olympus IX-70), amellyel a felületen mozgó élőlények, illetve azok ventrális oldala is jól tanulmányozható. Az alkalmazott nagy apertúrájú, kis mélységélességű objektív (1,3 NA Hl) kis mélységélessége miatt optikai szeletek felvételére alkalmas. A vízminta egy mikroakváriumban helyezkedik el, amelynek alját a fedőlemez alkotja, a folyadék oldalsó meniszkuszát egy középen köralakú lyukkal rendelkező műanyag lap biztosítja, a kondenzorlencse pedig beleér a vízmintába {la ábra). Bár a tárgylemez és a kondenzorolaj hiánya némi alulkorrekciót okoz, az elrendezés egy nagyon hasznos mechanikai pufferként szolgál: az objektív mozgatása során alig hat erő a víztérre, így a felületen kiülepedő aggregátumokat és az ott mozgó szervezeteket nem éri nyomás. Erős, sötétlátótérhez közeli Nomarski DIC kontrasztosítást alkalmaztunk, a sejteket 1500x nagyításon vizsgáltuk. Videofelvétel: A videofelvételeket egy analóg 3CCD kamerával készítettük (JVC KY-F30B). A jelet egy Analóg/Digitális konverter segítségével digitalizáltuk (Dazzle Hollywood DV Bridge, ill. Canopus ADVC-300), és számítógép merevlemezre rögzítettük. A digitalizálás során 4D zajszűrést is használtunk (különböző idejű képkockák összevetése statisztikai zajszűrésre). Az analóg videokamera használatának a következő előnyei vannak: a kamera paraméterei állíthatók, a digitalizálás során többlet fényerő és kontraszt adható a felvételekre, és a legfontosabb, hogy tömörítetlen felvétel rögzítése lehetséges a merevlemezre, így a video képkockái kivághatok és fényképként kezelhetők. Videofelvételek vizsgálata: A videofelvételek utólagos visszajátszásával a mozgó élőlények nyugodtan, képkockáról képkockára léptetve vizsgálhatók, részletesen megfigyelhetők. Ennek a ritka fajok vizsgálatában nagyon nagy jelentősége van. A videók elemzését többlet digitális kontrasztosítás mellett végeztük (VirtualDub). A mozgó képeken gyakran a leghalványabb struktúrák is észrevehetőek, melyek az állóképeken beleolvadnak a háttérzajba. A videofelvételek elemzésével a mozgások sebessége mérhető, illetve sejtmozgásoknál a sejtrészecskék nyomkövetése lehetséges (NikonPro). A videókból további képelemzés céljára képkockákat vágtunk ki (Pinaccle Studio Launcher), melyek mérete 720 x 580 pixel. Képelemzés: A képelemzés célja a képkockák átalakítása oly módon, hogy a legtöbb vizuális és mérési információ legyen megszerezhető a képből. A képelemzés során végzett főbb lépések az esetleges csíkok eltüntetése a képről, a zajszűrés és a kontrasztosítás. A következő műveleteket végeztük el: 1. a színes kép szürke-árnyalatossá tétele (Olympus CellD), 2. a kép Fourier-transzformációja. 3. a csíkokat okozó foltok törlése a Fourier-spe-