Hidrológiai Közlöny 2009 (89. évfolyam)
6. szám - L. Hidrológiai Napok: "A hazai hidrobiológia ötven éve" Tihany, 2008. október 1-3.
149 Proteáz aktivitás kimutatása vízvirágzásokat okozó cianobaktérium fajokból Mikóné Hamvas Márta, Vasas Gábor, Tomku Erika, Jámbrik Katalin, Máthé Csaba, Beyer Dániel, Bácsiné Béres Viktória, Borbély György Debreceni Egyetem TTK, Biológiai és Ökológiai Intézet, Növénytani Tanszék, 4010, Debrecen Egyetem tér 1. Kivonat: A fotoszintetizáló planktonikus szervezetek, köztük a prokarióta cianobaktériumok tömeges elszaporodása napjainkban már globális jelenség. Ezek a szervezetek számtalan szekunder anyagcsereterméket, köztük sok bioaktív molekulát termelnek, de közülük elsősorban a toxikus anyagcseretermékek az ún. cianotoxinok kutatottak. Kevesebb adat áll rendelkezésünkre olyan fontos enzimcsoportjaikról, mint például a proteázok, melyek alapfunkciójukon, a szervezetek fehéije anyagcseréjének szabályozásán túl, kulcsfontosságúak a sejtdifferenciálódásban, az apoptotikus folyamatokban, a stresszválaszok kialakításában is. Munkánk során néhány potenciálisan toxintermelő, a felszíni vizekben gyakran tömegesen elszaporodó cianobaktérium, a Microcystis aeruginosa, Cylindrospermopsis raciborskii és Aphanizomenon ovalisporum proteolitikus aktivitását vizsgáltuk. Poliakrilamid gélelektroforézis módszerével jelentős számú (4-11), a zselatint szubsztrátként hasznosító proteáz enzimet sikerült a cianobaktérium tenyészetekből kimutatni. Elemeztük ezek pH optimumát, aktivitásuk változását a tenyészet korának függvényében. A szervezetekre jellemző proteáz enzimmintázatok (zselatin-zimogramok) összehasonlításán túl azt is megállapítottuk, hogy ezek az enzimek kijutnak a víztérbe, mert a tenyészetek felülúszóiból jelentős proteáz aktivitások mérhetők. Kulcsszavak: Aphanizomenon ovalisporum, Cylindrospermopsis raciborskii, Microcystis aeruginosa, proteáz Bevezetés A cianobaktériumok számos olyan tulajdonsággal rendelkeznek (tartaléktápanyag granulumok, nitrogénkötő képesség, lebegést elősegítő gázvakuólumok megléte, kromatikus adaptációs képesség, különböző hatású és kémiai szerkezetű bioaktív molekulák szintézise), amelyek alkalmassá teszik őket arra, hogy bizonyos körülmények között az adott vízi életközösség többi tagját háttérbe szorítva elszaporodjanak (Bryant 1994, Kiss 1998, Chorus 1999, Kaebernick és Neilan 2001). Toxikus vízvirágzásról akkor beszélünk, ha a vízvirágzásban előforduló planktonszervezetek egértesztben toxikusnak minősülő anyagcseretermékeket, ún. toxinokat termelnek (Carmichael és Skulberg 1993). A toxikus vízvirágzásokat legtöbbször a cianobaktériumok, Anabaena, Aphanizomenon, Coelosphaerium, Microcystis, Nodularia, Nostoc, Cylindrspermopsis, Plankthotrix fajok idézik elő (Reynolds és Walsby 1975, Fay és Baalen 1986, Carmichael és Skulberg 1993). A cianobaktériumok tömeges elszaporodásának feltételeként az elegendő tápanyagon túl, a szélcsendes vagy enyhén szeles idő, 15-30 °C közötti vízhőmérséklet, a víz pH 6 és 9 közötti értéke kedvez (Carmichael 1994). A Balatonban 1934 óta már több ízben írtak le Microcystis aeruginosa Kütz, Microcystis flos-aquae (Wittr.), Anabaena flos-aquae (Lyngb.) Bréb. f. jacutica (Kissel.) Elenk., Aphanizomenon flos-aquae (L.) Ralfs., Cylindrospermopsis raciborskii tömegprodukciót (Hortobágyi 1962, Tamás 1965, Hortobágyi és Kárpáti 1967, Padisák és Istvánovics 1995, Padisák 1997, Vörös és V. Balogh 1997). A legnagyobb jelentőségű hazai vízvirágzás 1991-ben a Velencei-tavon következett be, egy egysejtű, sokezres kolóniát alkotó cianobaktérium, a Microcystis aeruginosa elszaporodása miatt (Kós és mtsai. 1995, Reskóné és mtsai. 2001). A toxikus vízvirágzást okozó M. aeruginosa törzs többféle mikrocisztint termel (MCY-RR, -YR, -LR), melyek közül legnagyobb mennyiségben a MCY-LR van jelen (Kós és mtsai., 1995). Ezek endotoxinok, tehát víztérbe kerülésük a sejtek pusztulásának a következménye. A Cylindrospermopsis raciborskii fonalas, az elemi nitrogén atmoszférából történő megkötésére képes szervezet, amelyet először Jáva szigetén izolálták 1912-ben, és trópusi cianobaktérium fajként írták le. 1978-ban találták meg először a Balatonban. Azóta több ízben idézett elő a nyári hónapokban vízvirágzást (Padisák és Istvánovics 1995, Padisák 1997). Az általunk laboratóriumi körülmények között nevelt Balatonból származó C. raciborskii izolátum a nevével ellentétben bizonyítottan nem termeli a cilindrospermopszin nevezetű toxint (Vasas és mtsai. 2002b). Az Aphanizomenon ovalisporum légköri nitrogén megkötésére képes fonalas faj, melynek kifejlett fonalain nitrát hiányában heterociszták, kedvezőtlen körülmények között pedig speciális kitartó- és szaporító képletek, akinéták differenciálódnak (Whitton 2002). Elsősorban trópusi területeken tömeges, de a mérsékelt övben, így hazánkban is előfordul (Padisák 1997, Vasas és mtsai. 2004). Az általunk vizsgált A. ovalisporum tenyészet a Kinneret-tóból (Izrael) származó, cilindrospermposzint termelő izolátum (Banker 1997, Vasas és mtsai. 2002a, Bácsi és mtsai. 2006). A proteáz enzimek által katalizált fehétjelebontásnak, proteolízisnek azon túl, hogy hozzáférhetővé teszi az aminosavakat új szintézisek számára, és a hibás fehéijék lebontásával segíti a sejt belső egyensúlyának fenntartását, még számos fiziológiai jelentősége van. A szakirodalomban nagyon sok adat található a gerinces állatok, hajtásos növények, gombák, a prokarióták közül az Escherichia coli, a fotoautotróf egysejtűek közül pedig egyes zöldalga mutáns törzsek proteáz enzimeiről (Gottesman és Maurizi 1992, Vierstra 1996, Gottesman 1999). Egysejtű zöldalga (Dunaliella tertolecta és Chlorella saccharophila) szervezetekben lejátszódó apoptotikus folyamatok vizsgálata során nyertek adatokat az eukarióta szervezetek proteolitikus aktivitással rendelkező fehérjéiről, - újonnan felfedezett kaszpáz-tipusú proteázokról, metakaszpázokról -, mint fontos apoptotikus markerekről (Deponte 2008). Cianobaktérium fajok közül Anabaena és Nostoc fajok heterociszta differenciálódását vizsgálva írtak le proteázokat (köztük Ca 2 +-dependens intracelluláris proteázokat, HetR proteineket, amelyek szerinproteázok), amelyek kulcsfontosságúak voltak a heterociszta differenciálódás szabályozásában (Maldener és mtsai. 1991, Dong és mtsai. 2000). Synechococcus és Synechocystis mutánsokban zselatin-bontó proteázokat mutattak ki, amelyek a PSII Dl proteinjének turnoverében, fényreguláit hasításában, azaz érésében, majd a molekula újraépülésében kulcsfontosságúak (Kanervo és mtsai. 2003). Kísérleteink célja volt annak megállapítása, hogy a szubsztrátként zselatint tartalmazó poliakrilamid gélelektroforézis módszerével (Schlereth és mtsai. 2000) kimutatható-e proteáz aktivitás a különböző korú, teljes táptalajon nevelt cianobaktérium tenyészetek intakt sejtjeiből, illetve a felülúszókból. Ehhez először optimalizálnunk kellett a kísérleti rendszerünket. Anyag és módszer Vizsgált tenyészetek: Microcystis aeruginosa (BGSD-243, DE TTK Növénytani T. törzs-gyüjtemény), az 1991. évi velencei-tavi toxikus vízvirágzásból származó izolátum (Kós és mtsai. 1995, Va-
