Hidrológiai Közlöny 2009 (89. évfolyam)

6. szám - L. Hidrológiai Napok: "A hazai hidrobiológia ötven éve" Tihany, 2008. október 1-3.

150. HIDROLÓGIAI KÖZLÖNY 2009. 89. ÉVF. 6. SZ. sas és mtsai. 2004). Tenyésztési körülmények: 0,5 literes üvegedény, Allén tápoldat (Allén 1968), sterilre szűrt, 4 %os C0

2 tartalmú levegővel buborékoltatás, 28 °C, folyamatos 100 pmol m"

2 sec"

1 megvilágítás. Aphanizomenon ovalisporum, az izraeli Kinneret-tóból származó toxintermelő izolátum (ILC-164, Banker és mtsai. 1997, Vasas és mtsai. 2002a, Bácsi és mtsai. 2007, BGSD423, DETTK Növénytani T. törzsgyüjtemény). Tenyésztési körülmények: 0,5 literes üvegedények, Allén tápoldat (Allén 1968), sterilre szűrt, 4 %-os C0

2 tartalmú levegővel buborékoltatás, 28°C, állandó 100 pmol m

2 sec"

1 megvilágítás. Cylindrospermopsis raciborskii, 1995-ben gyűjtött, cilindrospermopszint nem termelő balatoni izolátum (BGSD266, DE TTK Növénytani T. törzsgyűjtemény, Vasas és mtsai. 2002b). Tenyésztése: 0,5 literes üvegedényekben BG tápoldatban (Rippka és mtsai. 1979), buborékoltatás 28 °Con, sterilre szűrt, 4 %-os C0

2 tartalmú levegővel, folyamatos (24 h) 100 pmol m"

2 sec"

1 megvilágítás. Mintavétel, mintaelőkészítés, zselatin-zimogramok készítése és értékelése: Mintákat vettünk (3-4 ml) a különböző korú tenyészetekből, centrifugáltuk, és az összegyűjtött sejteket, valamint a felülúszóikat fagyasztottuk, liofílizáltuk, majd felhasználásig -20 °C-on tároltuk. Proteáz aktivitás kimutatásához a kivonópuffer: 100 mM Tris-HCl (pH: 8,0), benne 15 mM NaCl, l|il ml"

1 mercaptoetanol (Schlereth és mtsai. 2000), melyet a liofílizátumokhoz adtunk és azzal a mintákat felszuszpendáltuk. A sejttartalom hatékonyabb feltárásához a mintákat folyékony nitrogénben történő háromszori hirtelen lefagyasztás után kiolvasztottuk, centrifugáltuk (2x5 perc, 13000 rpm). A sejttörmelék mentes felülúszók fehérjetartalmát Bradford módszerével (1976) határoztuk meg. A proteáz enzimek kimutatása a Laemmli-féle poliakrilamid gélrendszer módosított formájával történt; a poliakrilamid gélekbe (0,4%) zselatint polimerizáltunk, majd a géleket a fúttatás és a megfelelő mosási lépések után (M-Hamvas és mtsai. 2003), az enzimek működéséhez optimalizált körülmények között (puffer, pH, hőmérséklet, időtartam) inkubáltuk. A szubsztráthoz kötődő festékekkel tettük láthatóvá (negatív festés) a szubsztrátot hasító fehéijék sávjait (Laemmli 1970, Schlereth és mtsai. 2000). Az alkalmazott pufferek: 100 mM Tris-HCl pH: 7,5-9,0, illetve 100 mM Na-foszfát pH: 4,5-7,0. A mintákkal párhuzamosan a molekulatömegek meghatározására szolgáló markert futtattunk (Low Molecular Weight Calibration Kit, Pharmacia). Eredmények A zselatint tartalmazó aktivitásgéleken (az előzetesen optimalizált vizsgálati körülmények között) mindhárom cianobaktérium törzs esetében tudtunk proteáz aktivitást kimutatni. Mindhárom szervezet sejtkivonatából lúgos pH-án lehetett több (izo)enzimet detektálni, a legszebb zselatin zimogramok Tris-HCl pH: 8,0-as pufferben történő inkubálással nyerhetők (1. ábra). Ha ugyanannak a törzsnek különböző korú tenyészeteiből vettünk mintát, a zselatin zimogramok különbségeket mutattak (2. ábra), bizonyítva, hogy a szervezetek enzimmintázata a tenyészet növekedésével változik. A korai exponenciális fázisban lévő (6-9 napos) tenyészetekből vett A. ovalisporum és M. aeruginosa sejtekben nagyobb számú izoenzim detektálható, mint a késői exponenciális fázisban lévő 11 napos, illetve a már öregedő (stacioner, 21,22 napos) tenyészetek sejtjeiben. Csak a fiatalabb tenyészetekben detektálhatok a kisebb moltömegű proteázok (80, 74, 58,45 kDa, illetve 93, 50 kDa tömegűek), az idősebb tenyészetekre a >100 kDa, moltömegű proteázok működése jellemző. Ezek minden mintában jelentős aktivitást mutató ún. konstitutív proteázok lehetnek (2. ábra). pHS.O pH:8,0 1. ábra, M. aeruginosa (243), C. raciborskii (266) és A. ovalisporum (423) 7 napos tenyészetek sejtkivonatainak zselatinbontó proteáz enzimei savas és lúgos körülmények között (7,5 %-os poliakrilamid-gélek, 2,5 pg protein/zseb, 5 h inkubálás 37 °C-on). A lassabban növekvő C. raciborskii tenyészet sejtjei viszonylag állandó enzimaktivitást és mintázatot mutatnak a tenyésztés 22. napjáig függetlenül attól, hogy az exponenciális (9-13 napos) vagy a korai stacioner (22 napos) tenyészetekből vettünk mintát. Jellemzője egy 47,5-50 kDa tömegű proteáz viszonylag állandóan magas specifikus aktivitása. A M. aeruginosa sejtek többiekétől eltérő proteáz enzime egy 85-93 kDa tömegű, ami a 6 napos tenyészetekben jelentős aktivitást mutat. 243 266 22 nap >112 109 106 pH:8,0 pH:8,0 2. ábra Különböző korú A. ovalisporum (423), M. aeruginosa (243) és C. raciborskii (266) tenyészetek zselatin-zimogramja (10 %-os gél, 5 pg protein/zseb, 6 h inkubálás 37 °C-on). 423 S 13 nap 3. ábra Különböző korú C. raciborskii (266) és A. ovalisporum (423) tenyészetek sejtfrakciójából (S) és a tenyészet felülúszójából (F) kimutatható proteáz enzimek, (pH: 8.0, 3 pg protein/zseb).