Hidrológiai Közlöny 2008 (88. évfolyam)
6. szám - IL. Hidrobiológus Napok: „A Balaton és vízrendszere – a Balaton-kutatás története” és „A Duna-kutatás története” Tihany, 2007. október 3–5.
47 A balatoni pikoalgák diverzitásának vizsgálata molekuláris módszerekkel Duleba Mónika 1, Felföldi Tamás 1, Somogyi Boglárka 2, Vajna Balázs 1, Vörös Lajos 2 és Márialigeti Károly 1 1 ELTE Mikrobiológiai Tanszék, 1117. Budapest, Pázmány Péter sétány 1/c. ( tamas.felfoldi@gmail.com) 2 MTA Balatoni Limnológiai Kutatóintézet, 8237. Tihany, Klebelsberg Kuno út 3. Kivonat: Az fotoautotróf pikoplankton (2 (ím alatti szervezetek) világszerte elteijedt, az idetartozó algák fontos szerepet játszanak a vízi ökoszisztémák életében. A Balatonban az elsődleges termelés akár 50%-át is adhatják. A pikoplankton szervezetek meghatározása klasszikus módszerekkel a legtöbb esetben nem lehetséges a kis méret és a morfológiai jegyek szűkössége miatt. Diverzitásuk vizsgálatára ezért molekuláris biológiai technikák alkalmasabbak. A Balatonból származó mintasorok elemzését PCR-alapú módszerekkel végeztük (klónozás és bázissorrend elemzés, valamint hosszpolimorfizmus vizsgálat). A klónozáshoz a cianobaktériumok és az eukarióta algák plasztiszainak 16S rDNS-ére specifikus primereket használtunk. A hosszpolimorfizmus esetében a pikocianobaktériumokra jellemző fikocianin operont (cpcA és cpcB és azok közötti, különböző hosszúságú nem kódoló régiót) vizsgáltuk. Eredményeink alapján megállapítottuk, hogy a balatoni pikoalgák diverzitása nagyobb, mint azt korábban a mikroszkópos és tenyésztéses vizsgálatok alapján gondoltuk. Kimutattuk a pikocianobaktérium-közösség összetételének térbeli (a Keszthelyi- és Siófoki-medence között) és szezonális (tavasztól őszig megfigyelt) változását. Egyes Synechococcus csoportok közösségen belüli arányajói korrelált a hőmérséklettel, illetve a klorofill-a koncentrációval. Kulcsszavak fotoautotróf pikoplankton, 16S riboszómális DNS, fikocianin operon, klónozás és bázissorrend elemzés, hosszpolimorfizmus. Bevezetés A 0,2-2,0 ftm-es plankton-szervezetek a pikoplankton kategóriába tartoznak. A pro- és eukarióta algákat egyaránt magába foglaló fotoautotróf pikoplankton (APP) elkülönítése a heterotróf szervezetektől autofluoreszcenciájuk alapján történik. A fotoautotróf pikoplankton világszerte elterjedt, fontos szerepet játszik vízi ökosziszté mák elsődleges termelésében tengerekben és tavakban egyaránt (Stockner, 1988). Az APP a Balatonban az elsődleges termelés akár 50%-át is adhatja (Vörös és mtsai, 1991). A legtöbb mérsékelt övi tóhoz hasonlóan az APP a Balatonban is kétfázisú eloszlást mutat, ami a vízhőmérséklet változásával van összefüggésben. Jégmentes időszakban 0,8-1,2 (xm-es kokkoid cianobaktériumok a fitoplankton domináns tagjai, míg a pikoeukarióták abundanciája ekkor jelentéktelen. Ezzel szemben a jéggel borított tóban a helyzet éppen fordított (Mózes és Vörös, 2004). Az APP abundanciája májusban mutatja az első csúcsot, majd a magas vízhőmérséklet ellenére hirtelen lecsökken, aminek oka a fonalas N 2-kötő cianobaktériumok elszaporodása. A második csúcs szeptemberben vagy október közepén figyelhető meg (Vörös és mtsai, 1991; Mózes és mtsai, 2006). A 0,2-2,0 )im-es planktonszervezetek a pikoplankton kategóriába tartoznak. A pro- és eukarióta algákat egyaránt magába foglaló fotoautotróf pikoplankton (APP) elkülönítése a heterotróf szervezetektől autofluoreszcenciájuk alapján történik. A fotoautotróf pikoplankton világszerte elterjedt, fontos szerepet játszik vízi ökoszisztémák elsődleges termelésében tengerekben és tavakban egyaránt (Stockner, 1988). Az APP a Balatonban az elsődleges termelés akár 50 %-át is adhatja (Vörös és mtsai, 1991). A pikoplankton taxonómiájáról a sejtek kis mérete és a morfológiai jegyek szűkössége miatt klasszikus módszerekkel kevés információ szerezhető. Természetes körülmények közti észlelését az epifluoreszcens mikroszkópia alkalmazása tette lehetővé (Daley és Hobbié, 1975). Autofluoreszcencia alapján a pikocianobaktériumok közt kétféle sejttípus fordul elő: a kék gerjesztőfény hatására sárgán fluoreszkáló fikoeritrinben gazdag, illetve a vörösen fluoreszkáló fikocianinban gazdag formák ( Wood és mtsai, 1985; Callieri és mtsai, 1996). A fentiek miatt a pikoplankton diverzitásának meghatározására molekuláris módszereket kezdtek alkalmazni az utóbbi néhány évben, melyek a riboszómális DNS és fehérjekódoló gének vizsgálatán alapultak (Urbach és mtsai, 1998; Turner és mtsai, 1999; Robertson és mtsai, 2001). Célul a klasszikus módszerekkel viszonylag egységesnek tünő balatoni pikoalga közösség genetikai diverzitásának vizsgálatát tüztük ki, valamint a közösség összetételének időbeli és térbeli változását is figyelemmel kísértük. Mindkét vizsgálathoz PCR-alapú molekuláris technikákat használtunk. A genetikai diverzitásról klónozással és azt követő bázissorrend elemzéssel szereztünk információt, amelyhez a 16S riboszómális RNS génjét (16S rDNS-t) használtuk fel. A közösségi összetétel változását az egyszerre több minta gyors feldolgozására alkalmas hosszpolimorfizmus vizsgálattal követtük nyomon. Ez utóbbinál a fikocianin operont vizsgáltuk, melyben a cpcA és cpcB közti nem kódoló (IGS) régió hossza a pikocianobaktériumoknál szoros összefüggést mutat a filogenetikai csoportokkal (Robertson és mtsai, 2001; Crosbie és mtsai, 2003). Anyag és módszer Munkánk során a Siófoki- és Keszthelyi-medencéből kéthetente vett vízoszlop mintákat vizsgáltuk. A klónozást a 2005. októberében Keszthelynél vett mintán végeztük. A klorofill-a koncentráció meghatározása Wetzel és Likens (1991) alapján történt. A DNS kivonását folyékony nitrogén és polivinil-polipirrolidinnel kiegészített CLS-Y oldat (Q-Biogene) segítségével, a tisztítást G-Spin 1 M Genomic DNA Extraction Kit (iNtRON) felhasználásával végeztük. A PCR során az 1. táblázatban közölt primereket alkalmaztuk a Nübel és mtsai (1997), valamint Robertson és mtsai (2001) által megadott paraméterek alapján. A 16S rDNS klónozását pGEM®-T Easy Vector (Promega) rendszerrel végeztük el. A klónokat SSMRI és Hin61 restrikciós endonukleázokkal csoportosítottuk. A csoportokból egy, illetve néhány tag bázissorrend elemzését végeztük el (BigDye"' Terminator v3.1 Kit, Applied Biosystems). A szekvenciákat nukleotid adatbázissal hasonlítottuk össze (Altschul és mtsai, 1997). A filogenetikai fát MEGA4 (Tamura és mtsai, 2007) programcsomaggal szerkesztettük (Neighbor-Joining), amihez felhasználtuk a Balatonból izolált pikocianobaktérium törzsek szekvenciáit is (Ernst & mtsai, 2003; Felföldi &mtsai, 2007). A hossz-polimorfizmus vizsgálatánál a fluoreszcens HEX-jelöléssel ellátott cpcBF primerrel fel szaporított
