Hidrológiai Közlöny 2008 (88. évfolyam)

6. szám - IL. Hidrobiológus Napok: „A Balaton és vízrendszere – a Balaton-kutatás története” és „A Duna-kutatás története” Tihany, 2007. október 3–5.

48 HIDROLÓGIAI KÖZLÖNY 2008. 88. ÉVF. 6. SZ. DNS-t egy méretmarker (GeneScan™-500, Applied Biosystems) és a pikocianobaktérium törzsek TET-jelölésü PCR-termékének keveréke mellett kapilláris elekroforézissel hossz szerint választottuk el egymástól. A markerek csúcsaihoz viszonyítva taxonómiai egységeket (OTU = Operational Taxonomic Unit) határoztunk meg (GeneMapper program). A kromatogramokon a csúcsok alatti terület arányos az adott pikocianobaktérium csoport DNS-ének és így a kiindulási mintában lévő pikoalgáknak a mennyiségével. Az egyes csúcsok alatti területek összes csúcs alatti területhez viszonyított arányait a Microsoft® Excel program KÖRREL függvénye segítségével korreláltattuk a klorofill-a koncentrációval és a hőmérséklettel. Az összterület 1%-a alatti csúcsokat a zaj zavaró hatása miatt kihagytuk a vizsgálatból. Eredmények A 16S rDNS alapú klónozás során 209 klónt kaptunk, amelyek közül három volt kevert, vagyis egyszerre több inszert szekvenciáját tartalmazta. Három klón Verrucomicrobiales eredetű volt, tehát ekkor nem a célcsoport került PCR-rel felszapoításra, ezért ezeket a klónokat kihagytuk az elemzésből. A legtöbb klón Synechococcushoz (Cyanobiumhoz) hasonló szekvenciát tartalmazott (173 klón), ezek valamennyien a pikofitoplankton kládba (Úrbach és mtsai, 1998) tartoztak. Kisebb számban más cianobaktériumot is sikerült kimutatni: Planktothrix sp. (6 klón), Snowella litoralis (11 klón), Aphanizomenon/ Anabaena csoport (1 klón), Oscillatoria/Limnothrix/ Pseudoanabaena csoport (3 klón). A legkevesebb szekvencia eukarióta algák plasztiszaiból származott: Stephanodiscus minutulus (6 klón), Dinophysis sp. (1 klón), tenyésztetlen fototróf eukarióta (2 klón). Ezek közül a pikofitoplankton kategóriába csak a Synechococcus nemzetség tartozik, a többi alga 2 pm-nél nagyobb méretű. A balatoni szekvenciák (törzs és klón) a pikofitoplankton kládon belül kilenc csoportban helyezkedtek el (/. ábra), nyolc csoportba estek a klónjaink, egy kilencedik csoportba pedig egy kivételével az összes Balatonból izolált törzs (Cyanobium gracile csoport, IX). Az ACT 9807 törzs egy csoportba (III) került a Ke 175-ös és a Ke88-as klónnal. A legtöbb pikocianobaktérium klónt (104 darab) tartalmazó csoportot (II) a Ke20 és Kel35 jelű szekvenciák képviselték. A következő leggyakoribb csoport (VIII) ennél lényegesen kevesebb klónt (17 darab, Ke72 és Kel 11 szekvenciák) tartalmazott. A többi csoportba csak néhány, csoportonként 1-10 klón tartozott. A cpcBA-IGS régió hosszpolimorfizmusa alapján diverzitás vizsgálatot korábban még nem végeztek a pikofitoplankton kládra vonatkozóan. A módszer megismételhetőségét három minta esetében végzett két párhuzamos elektroforézis futással teszteltük. Valamennyi esetben az egyes csúcsok alatti területek eltérése 5 %-nál kisebbnek adódott. A módszer felbontása 2-3 bázispárnak bizonyult. A hosszpolimorfizmus alapján 12 Synechococcus csoportot tudtunk elkülöníteni (OTU1-12, 2. és 3. ábra). A keszthelyi mintákban nyolc csoportot mutattunk ki. Közülük az OTU5-ÖS, OTUlO-es és OTUll-es csoport a klorofill-a koncentrációval, az OTU2-es és OTU6-os pedig a hőmérséklettel mutatott pozitív korrelációt, míg az OTU3-as a klorofill-a koncentrációval és a hőmérséklettel, az OTU7-es pedig a hőmérséklettel korrelált negatívan. A Siófoki-medencéból származó mintákban 10 különböző Synechococcus csoport jelenlétét igazoltuk. Esetükben csak a hőmérséklettel találtunk összefüggést, az OTU2-es, OTU6-OS, OTU8-as pozitívan, míg az OTU3as és OTU5-ÖS negatívan korrelált. (/. táblázat) Értékelés A klasszikus módszerekkel (epifluoreszcens mikroszkópia, tenyésztés) végzett vizsgálatok a balatoni pikoalga közösséget kevéssé diverznek mutatták. Mózes és mtsai (2006) megfigyelései szerint a pikoplankton három típusa különböztethető meg a Balatonban autofluoreszcencia alapján: fikoeritrin-gazdag kokkoid cianobaktériumok, fikocianin-gazdag cianobaktériumok és fikobiliprotein hiányos, vörösen fluoreszkáló kisméretű eukarióták. Tenyésztésbe eddig a Balatonból kilenc törzset vontak, amelyek filogenetikailag két különböző pikocianobaktárium csoport képviselőinek tekinthetők (Felföldi és mtsai, 2007). Vizsgálataink alapján tenyésztéstől független molekuláris technikákkal sokkal diverzebbnek láttuk a fotoautotróf pikoplankton közösséget. A klónozás a pikoplankton mérettartományból csak cianobaktériumokat mutatott ki, eukariótákat nem. Ez egybevág azzal a mikroszkópos megfigyeléssel, hogy a jégmentes Balatonban a pikoeukarióták mennyisége jelentéktelen a pikoprokariótákhoz képest (Mózes és Vörös, 2004). Klónjaink egy nagy része tenyésztésbe nem vont környezeti klónokéhoz hasonló szekvenciát tartalmazott, ezeknek fiziológiai tulajdonságairól nincsenek ismereteink, de a tenyésztésbe vont és molekuláris módszerekkel vizsgált törzseknél is kevés számú fiziológiai vizsgálatot végeztek eddig. A filogenetikai fán a Balatonból származó klónok és a törzsek elkülönültek, kivéve a III csoportot. Ez egyrészt a tenyésztés szelektivitásával magyarázható, másrészt azzal, hogy más volt a mintavétel időpontja. A klónozással kapott eredményekből kiindulva a térbeli és időbeli változás vizsgálatához jégmentes időszakban vett minták hosszpolimorfizmus elemzését végeztük el Synechococcusokra specifikus primerekkel. A módszer alkalmasnak bizonyult a közösség-összetétel változásának térbeli és szezonális követésére. Egyes pikocianobaktérium csoportok csak Keszthelynél, mások csak a Siófoki-medencében fordultak elő, míg voltak, amelyek jelenlétét mindkét mintavételi helyen kimutattuk. A különbségek oka valószínűleg abban rejlik, hogy más környezeti hatások érik a Balaton különböző részein élő közösségeket. Az egyik jelentős ilyen hatás a Keszthelynél beömlő Zala által hozott nitrogén- és foszfor-terhelés lehet, mely megnöveli a trofitási szintet is a Siófoki-medence vizéhez képest. Az időbeli változásokat követve megállapítottuk, hogy számos Synechococcus csoport közösségen belüli aránya korrelált a klorofill-a koncentrációval vagy a hőmérséklettel. Molekuláris biológiai vizsgálatainkkal párhuzamosan a hazai pikoalga törzsek fiziológiai jellemzése során szintén megállapítást nyert bizonyos környezeti faktorok szezonális dinamikát meghatározó szerepe (Somogyi és mtsai, 2007; Vanyovszki és mtsai, 2008). Köszönetnyilvánítás A munkát az OTKA (T042977) támogatta.