Hidrológiai Közlöny 2008 (88. évfolyam)
6. szám - IL. Hidrobiológus Napok: „A Balaton és vízrendszere – a Balaton-kutatás története” és „A Duna-kutatás története” Tihany, 2007. október 3–5.
31 Ipari hűtővíz bakteriológiai vizsgálata tenyésztéses és molekuláris módszerekkel Bohus Veronika 12, Szoboszlay Márton 1, Márialigeti Károly 1' 2, M. Tóth Erika 1 Eötvös Loránd Tudományegyetem, Mikrobiológiai Tanszék, 1117. Budapest, Pázmány Péter sétány 1/C. 2ELTE Környezettudományi Kooperációs Kutató Központ, 1117. Budapest, Pázmány Péter sétány l/A. Kivonat: Számos ipari létesítményben gondot okoz az általuk használt ultra tiszta vizek mikrobiális szennyezettsége. A mikrobák nemcsak a vizekben fordulnak elő, hanem biofilmek képzése révén a rendszer számos pontján megtelepednek, és korróziós folyamatokat indíthatnak. Vizsgálataink során egy ilyen ipari hűtővíz rendszer térfogat kiegyenlítő tartályának bemenő (TKE) és kimenő (TKU) ági vizét vizsgáltuk. A tenyésztést oligotróf tápközegben végeztük. Random izolálást követően a baktériumokat zsírsav profiljuk alapján csoportosítottuk. A fenon reprezentánsokat és a nem csoportosuló törzseket 16S rDNS bázissorrend elemzéssel vizsgáltuk. Ezzel egyidejűleg 11-11 liter vízminta szürletéből közvetlen DNS kivonás után T-RFLP analízist végeztünk, a csúcsok azonosításához egy, már előzőleg létrehozott klónkönyvtárat használtunk. A tenyésztéses vizsgálat alapján mindkét vizet az aerob, kemoorganotróf a-proteobaktériumok dominanciája jellemezte, azonban a TKU mintában a tenyészthető heterotróf csíraszám nagyságrendbeli növekedése mellett a mikróba-közösség összetétele is változatosabb képet mutatott: az a-proteobaktériumok eddig meglévő fajai mellett újabbak is megjelentek, valamint fellelhetők a ß- és y-proteobaktériumok és Gram-pozitív baktériumok képviselői is. A T-RFLP módszer segítségével is komplex mikrobiális közösséget találtunk, jellemző továbbá a bakteriális közösségi összetételváltás: a TKE mintát domináló cianobaktériumok és aproteobaktériumok helyébe a TKU mintában a p-proteobaktériumok, a CFB csoport képviselői és Gram-pozitív baktériumok léptek. Kulcsszavak: oligotróf víz, baktérium, tenyésztés, szekvencia analízis, T-RFLP. Bevezetés Számos ipari létesítmény (pl. félvezető ipar, gyógyszeripar, ipari fűtő rendszerek, erőművek) szenved az általuk nyersanyagként, hűtővízként használt ultra tiszta vizek (UPW) mikrobiális szennyezettségétől, mivel a különböző vízzel érintkező felületek (tartályok, csőfelületek) ideális helyet nyújtanak a bakteriális adhéziónak (Kulakov és mts., 2002). A mikrobák kedvezőtlen körülmények között a felületen megtelepedve fiziko-kémiai védelmet nyújtó poliszacharid mátrixba ágyazódva mikrobiális konzorciumot, biofilmet képeznek Ezek pedig biológiai romlási folyamatokat és/vagy mikrobiálisan indukált korróziós folyamatokat (MIC) indíthatnak (Charaklis és Marshall, 1990). Az iparban használt nagy tisztaságú vizek az ember számára kiemelt fontosságúak, így az elmúlt évtizedben nagy figyelem irányult az ipari UPW-k mikrobiális vizsgálatára, folyamatos monitorozására. A MIC jelenséget korábban már számos erőműben detektálták, vizsgálták, melyből számos publikáció született (Soini és mts., 2002; Wolfram és Dirk, 1997). Annak ellenére, hogy a nagy tisztaságú vizekben a szerves és szervetlen anyagok koncentrációja kicsi, az ilyen kis ozmotikum és tápanyag tartalommal jellemezhető közegek számos mikroorganizmus számára kitűnő élőhelyet biztosítanak (Patterson, 1991; Poindexter, 1981). A mikrobák egy csoportja, az ún. oligotróf szervezetek az ilyen szélsőséges paraméterekkel rendelkező környezetekhez (l-15mg C/liter) is tudnak adaptálni (Penna és mts., 2002). Számos kutatás irányult ezen baktérium fajok felderítésére; a kutatások kimutatták, hogy a heterotróf baktérium fajok, pl. az Escherichia coli, Bacillus megaterium, Pseudomonas aeruginosa, Ralstonia insidiosa, Afipia felis, Bradyrhizobium elkanii, Staphylococcus citerus, Delftia acidovorans, Dyella japonica, Cycloclasticus oligotrophus fajok 0,4 ppm C/liter tartalmú környezetekben is képesek szaporodni (Cavicchioli és mts., 1999; Saito és mts., 1998; Soini és mts., 2002; Xie és Yokota, 2005). Napjainkban végzett kutatások rámutattak, hogy a nagy tisztaságú vizek fő kolonizáló szervezetei a különböző proteobaktériumok, a biofilm alkotásában és enterotoxinok termelésében fő szerepet játszó Pseudomonas fajok dominanciájával (Matsuda 1996; Kulakov & mts 2002). Megtalálhatók még ezen kívül Gram-pozitív baktériumok (pl. aktinobaktériumok), valamint élesztők, algák képviselői is a vízben, komplex mikrobiális közösségeket alkotva (Sarró és mts. 2005). Munkánk célja egy magyarországi erőmű hűtővízrendszerében található térfogat kiegyenlítő tartály bemenő- és kimenő ági vizének összehasonlítása volt a mikrobiális öszszetétel és a feltételezhető mikroba feldúsulás tükrében. Vizsgálati anyag és módszerek Mintavétel A térfogat kiegyenlítő tartály (TK) bemenő (TKE) és kimenő (TKU) ági vizét mintáztuk. Mindkét oldalról 12-12 liter vízmintát gyűjtöttünk steril csavarkupakos üvegekben. Minták feldolgozása A teljes csíraszám meghatározásához a vízmintákat (400 -400 ml) 2 %-os paraformaldehid oldattal fixáltuk, majd leszűrtük (0,45 pm, Sartorius). A filtert lpg/ml DAPI (4',6diamidino-2-fenilindol) festékoldattal festettük. A mintákat epifluoreszcens mikroszkóppal (Nikon 80i) vizsgáltuk és ImageProPlus programcsomag segítségével értékeltük. A vízminták feldolgozása során a vizekből R2A táptalajon (Reasoner és Geldreich, 1985) közvetlen szélesztést végeztünk. 5-7 napig 28°C-on való inkubálás után nem szelektív módon baktériumtelepeket izoláltunk, majd tisztítottunk, továbbá heterotróf csíraszám becslést végeztünk. Az első átoltások során néhány izolátum kipusztult, ezért végül 12 TKE és 32 TKU baktérium törzzsel dolgoztunk. A baktériumok citoplazma membrán zsírsav összetétele alapján (standard tenyésztést követően) csoportosíthatók (Embley és Wait, 1994) így az izolált 44 baktériumtörzs 24 órás ferde agar tenyészeteiből membránzsírsavakat preparáltunk. A megfelelő illékony metilészterek kialakítása után a zsírsavakat gázkromatográffal elemeztük (HP1 kapilláris oszlop, HP5890, BAME standard). A kapott zsírsav összetételekkel Syntax 2000 programcsomag (Podani, 2001) segítségével csoportanalízist végeztünk (UPGMA, SM koefficiens). A csoport reprezentánsok és a csoportba nem sorolt törzsek 24 órás ferde agar tenyészeteiből V-Gene kit (BioRad) segítségével DNS-t izoláltunk. A baktériumok 16S rRNS génjét PCR segítségével elszaporítottuk (27F és 519R primerek). A PCR termék tisztítását PCR M™ Clean Up System kit (Viogene) segítségével végeztük. A szekvenáláshoz a Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kitet (Applied Biosystems) alkalmaztuk (27F primer), majd mintáinkat automata genetikai analizátor (Applied Biosystems Model 310) segítségével vizsgáltuk. A GenBank adatbázisban (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov) található szekvenciák közül a tör-
