Hidrológiai Közlöny 2008 (88. évfolyam)

6. szám - IL. Hidrobiológus Napok: „A Balaton és vízrendszere – a Balaton-kutatás története” és „A Duna-kutatás története” Tihany, 2007. október 3–5.

32 HIDROLÓGIAI KÖZLÖNY 2008. 88. ÉVF. 6. SZ. zseink szekvenciájához leginkább hasonlókat NCBI BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) algoritmus (Altschul és mts., 1997) segítségével kerestük meg. A terminális restrikciós fragmenthossz polimorfizmus (T -RFLP) vizsgálat során a jelölt, felszaporított 16S rDNS szekvenciát restrikciós enzimmel/enzimekkel hasítjuk. A hasítási mintázatot egy, hasonló vízmintákból előre elkészített klónkönyvtárban lévő baktériumok hasítási mintázataival összevetve nagy valószínűséggel nemzetség/faj szinten azonosítani tudjuk. Mind a TKE, mind a TKU vizekből 11-11 liter mennyiséget 0,45 um pórusméretű membránszűrőn (Sartorius) szűrtünk, majd a szűrőről Ultra Water Clean DNA Kit (MOBIO) segítségével közvetlenül DNS-t izoláltunk, majd a mintából 16S rDNS specifikus PCR reakciót végeztünk (27F-TET és 519R primerpár). A terméket ezután Alul restrikciós enzimmel 37 °C-on 3 órán keresztül emésztettük. A fragmentelemzést ABI Prism™ 310 Genetic Analyser (Perkin Elmer) berendezéssel végeztük. Eredményeinket a GeneScan programcsomag segítségével értékeltük. Eredmények és értékelésük • TKE • TKU a-proteobakt. ß- proteobakt. y-proteobakt Gram pozitív baktériumok főbb baktérium csoportok 1. ábra.Nagytisztaságú ipari vízből nyert baktériumtörzsek megoszlása a főbb baktérium csoportok s a vízminták szerint A direkt szélesztésből heterotróf csíraszámot becsültünk, mely a tartály előtti vízminta (TKE) esetén 10 CFU/ml-nek, a tartály utáni vízminta (TKU) esetén 390 CFU/ml-nek adódott. A direkt számolás eredményeként a totál csíraszámok a TKE minta esetén 2,82*10

4-nek, a TKU minta esetén 8,35*10

4-nek adódtak, tehát a tenyésztésnél kapottnál 2 ill. 3 nagyságrenddel magasabbak. Mindkét módszerrel igazolható, hogy a baktériumok a víztartályban (TK) való tartózkodás során dúsulnak, amit Hirsch és mts. (1992) kísérletei is igazolnak. A dúsulás feltételezett oka lehet a tartályban lévő víz pangása, mint kialakuló kedvező feltételek, vagy az időnkénti víztestmozgásoknak köszönhetően a tartály falán lévő biofilmek leszakadása, vízbe kerülése. A vízből izolált 44 baktérium taxonómiai pozícióját és a csoportok előfordulási gyakoriságát az 1. táblázat tartalmazza. A két vízmintában lévő főbb baktérium csoportok vízmintánkénti megoszlását az 1. ábra szemlélteti. A mintákat a TK tartály előtt és után is az aerob, kemoorganotróf a-proteobaktériumok dominanciája jellemzi. A tartály előtti vízmintában (TKE) szinte csak a-proteobaktériumok találhatók meg (Bradyrhizobium elkanii, Bradyrhizobium japonicum, Chelatococcus asaccharovorans, Mesorhizobium huakuii). A tartály utáni vízben (TKU) a mikróbaközösség összetétele változatosabb képet mutat: az a-proteobaktériumok eddig meglévő fajai mellett újabbak is megjelennek (Afipia felis), valamint fellelhetők a ß- (Sterolibacterium sp.) és y-proteobaktériumok (feltételezhetően Dyella nemzetség), valamint a Gram-pozitív baktériumok (Mycobacterium neoaurum, Mycobacterium ginsengisoli, Staphylococcus epidermidis, Brevibacillus borstalensis) képviselői is. Ezen kivül sikerült eddig tenyésztésbe nem vont a- és y-proteobaktériumokat kitenyésztenünk, ezek metabolikus aktivitásának tesztelése a későbbiekben valósul meg. Az izolált baktériumok egy része kis szervesanyag-koncentrációjú környezetekben általában jellemző (Chen és mts., 2004). Sok közülük természetes környezetekből könnyen izolálható (víz, talaj, növényi felszínek), néhány közülük opportunista patogénként ismert (

Mycobacterium sp., Staphylococcus sp.). Az általunk azonosított Mycobacterium fajok azonban nem ismertek patogénként, a vizekben általában megtalálhatók (Dantec és mts., 2002). A kitenyésztett baktériumok gyakran képesek nehezen degradálható szubsztrátok, aromás vegyületek bontására, sok képes a légköri nitrogén megkötésére, több közülük nitrát légző, néhány hidrogén autotróf. Tenyésztéses eredményeink egyeznek Sarró és mts. (2005, 2007) tapasztalataival: az általuk vizsgált ipari hűtővízben található baktériumok számos nagyobb filogenetikai csoportba (a-, ß-, yproteobaktériumok, aktinobaktériumok és Firmicutes) tartoztak. Ipari vízrendszerek ultra tiszta vizeiben (pl. atomerőmüvek vízellátó rendszerei) a mikroorganizmusok táplálékául szolgáló szerves anyagok forrása sokrétű (ioncserélő gyanták, bevonatul szolgáló gumi és műgyanta felületek, humin anyagok, autotróf mikroorganizmusok szaporodása, anyagcseréje). 1. táblázat. A vízmintákból kitenyészthető baktériumcsoportok és filogenetikai rokonságuk 16S rDNS bázissorrend elemzés alapján Filogenetikai csoport Legközelebbi rokon baktérium taxon Parciális 16S rDNS szekvencia hasonlóság (%) Fenon méret (db) Filogenetikai csoport Legközelebbi rokon baktérium taxon Parciális 16S rDNS szekvencia hasonlóság (%) TKE TKU a-proteo baktériumok Bradyrhizobium elkanii NW-6 / Bradyrhizobium japonicum WmE 100/ 99 5 17 a-proteo baktériumok Chelatococcus assacharovorans CP 141 b 96-97 1 0 a-proteo baktériumok Mesorhizobium huakuii IAM 14158 99 5 1 a-proteo baktériumok Afipia felis 76713 98-99 0 1 a-proteo baktériumok nem tenyésztett a-proteobaktérium 100 0 2 ß-proteo baktériumok nem tenyésztett Streolibacterium sp. 98 0 1 y-proteo baktériumok Dyella japonica / koreensis BB4 95/ 96 0 2 Grampozitív baktériumok Mycobacterium neoaurum ATCC25795 / Mycobacterium ginsengisoli G soil 259 100 1 2 Grampozitív baktériumok Staphylococcus epidermidis TD37 100 0 1 Grampozitív baktériumok Brevibacillus borstelensis LMG 15536 100 0 5 A tenyésztéstől független vizsgálatok eredményét az alul restrikciós enzimmel kapott T-RFLP kromatogramok szemléltetik (2. ábra). A kromatogram csúcsait egy már előzőleg elkészített klónkönyvtár alapján azonosítottuk. A kromatogramokat összehasonlítva számos különbség fedezhető fel, bár mindkét minta diverz T-RFLP profillal jellemezhető. Különbségek főként a baktériumok összetételében és a bakteriális közösségi összetétel-váltásban mutatkoznak. A bejövő (TKE) vízmintát a Cyanobacterium-ok és az a-proteobaktériumok (Sphingomonas sp., Novosphingobium hassiacum) dominálják. A kifolyó vízmintában (TKU) a dominancia viszonyok megváltoznak: uralkodó szervezetekké a ß-proteobaktcrumok (Rhodoferax sp., Polynucleo-