Hidrológiai Közlöny 2007 (87. évfolyam)
6. szám - XLVIII. Hidrobiológus Napok: Európai elvárások és a hazai hidrobiológia Tihany, 2006. október 4–6.
184 HIDROLÓGIAI KÖZLÖNY 2007. 87. ÉVF. 6. SZ. koppal, a mennyiségi vizsgálatokat pedig Leica DM1L fordított mikroszkóppal végeztük. Vízkémia: A vízkémiai vizsgálatok a Tiszántúli Környezetvédelmi, Természetvédelmi és Vízügyi Felügyelőség (TKTVF) laboratóriumában történtek, az adott komponensekre jelenleg érvényes magyar szabványok szerint. Toxintesztek: A statikus hal- daphnia- mustár csíranövény-tesztek kivitelezése a Debreceni Egyetem Növénytani Tanszékén történt az adott tevékenységre jelenleg érvényes magyar szabványok szerint. A hemolitikus tesztet a Magyar gyógyszerkönyv VII. kiadásában szereplő leirat alapján végeztük. Proteáz aktivitás: Az enzim-méréséhez a Prymnesium parvum sejtek liofilizátumát használtuk, a nyers fehérjekivonat készítése 100 mM-os Tris-HCl puffer (pH = 8,0) hozzáadásával történt. A sejt-tartalom feltárásához a mintákat folyékony nitrogénben történő kétszeri hirtelen lefagyasztás, majd kiolvasztás után centrifugáltuk (2><5 perc, 13000 rpm), és a felülúszót felhasználásig kis térfogatokban -20 °C-on tároltuk. Összehasonlításként az előbbi módszerrel kivonatokat készítettünk cianobaktérium tenyészetek liofilizátumaiból (Aphanizomenon ovalisporum BGSD-423, Microcystis aeruginosa BGSD-243 törzstenyészetek). A proteáz aktivitással rendelkező fehéijék hatékony elválasztására Schlereth és mtsai. (2000) módszerét alkalmaztuk. A módszer a Laemmli-féle gélrendszer (Laemmli, 1970) módosított változata, amelynek lényege, hogy a 7,5 vagy 10 %-os poliakrilamid gélbe szubsztrátként zselatint (vég-koncentráció 4 %) polimerizálunk. A vizsgálatokhoz 13 x IO x 0,1 cm méretű géleket (V = 12 ml) alkalmaztunk. Eredmények és megbeszélésük A hajdúszoboszlói Téglagyári Öregtavon különböző halfajok tömeges pusztulását figyeltük meg 2005. július 6-án (1. táblázat). Az elpusztult egyedek kopoltyúfedőin és a végbél-nyílásuk környékén jellegzetes bevérzéseket észleltünk. Az élő egyedek jelentős része pipált, illetve partközeli koordinálatlan mozgás volt rájuk jellemző. 1. táblázat. A hajdúszoboszlói Téglagyári Oregtavon Faj Mennyiség (tömeg) Fehérbusa - Hvpophthalmichtys nobilis R. 8-10 q Amur - Ctenopharingodon idella Valenciennes 2q Ponty - Cyprinus Carpio L. 1,5-2 q Folyami harcsa - Silurus glanis L. 2q Törpeharcsa - Ameiurus nebulosus (Lesueur) Ezüstkárász - Carassius carassius L. 1 kg alatti egyedek ~5-10 q segítségével megállapítható volt, hogy a vízből származó minta erősen mérgező. A halteszt expozíció ideje ugyan 96 óra, de a viz eredeti töménységében már 10 perc elteltével 100 %-os mortalitást mutatott, és csupán 11 szeres hígítás esetén sikerült LD 5 0 értéket kalkulálnunk. A daphnia-teszt hasonló eredményeket hozott. A csiranövény-tesztben erőteljes toxikus hatást nem sikerült kimutatni. 2. táblázat. A hajdúszoboszlói Téglagyári Öregtó oldott oxigén, pH, fajlagos vezetőképesség és ammónium Oldott oxigén MSZ ISO 5813: 1992 7,7 mg/l pH MSZ 448-22: 1985 8,2 Fajlagos vezetőképesség MSZ EN 27888: 1998 2242 pS/cm Ammónium MSZ ISO 7150-1: 1992 0,05 mg/l A Prymnesium parvum toxicitásának megerősítésére, beállítottunk egy specifikus tesztet, amely kifejezetten a hemolitikus anyagokat tartalmazó közegek tesztelésére alkalmas. A teszt lényege, hogy hígított fibrinmentes borjúvért kezeltünk vízmintával. Míg a kontroll-rendszerben a vörösvértestek a hemoglobin tartalmukkal ülepednek, addig a hemolitikus anyag(ok) hatására a vörösvértestek degradálódnak, szétesnek, és a hemoglobin a felülúszóba kerülve nem ülepszik, ezért vörös színűre festi az oldat felülúszóját Az egyik legismertebb hemolitikus komponenseket tartalmazó anyag a szappangyökér növény kivonata, amelynél a Prymnesium parvum kivonata szárazanyag-tartalomra vonatkoztatva kb. 500-szor erősebbnek mutatkozott. A hemolitikus tesztet megismételtük szilárd táptalajon, amely borjúvért tartalmazott (későbbiekben véres agar). A véres agarra a Prymnesium parvum sejteket tartalmazó vízminta egy-egy részletét, Prymnesium sejteket nem tartalmazó vízminta, illetve desztillált víz egy-egy részletét cseppentettük fel. A Prymnesium sejteket tartalmazó minta esetében a véresagar felszínén erőteljes „Iízis-foltot" figyelhettünk meg, amit a szervezet kivonata a táptalaj komponenseinek kiemésztésével idézett elő (/. ábra). Helybéli horgászok szerint 5-10 évente hirtelen, nagy mértékű halpusztulás következik be a tavon, amikor is a 2005. évinek megfelelő mértékben, a víz halfaunájának jelentős része elpusztul. Vízkémiai paraméterek alapján a halpusztulás az oldott oxigén, illetve az ammónia tartalom alapján nem volt magyarázható, azonban feltűnő volt a víz magas vezetőképessége (2. táblázat). Ezzel párhuzamosan a tó vize jellegzetes aranysárga elszíneződést mutatott, egy a víztérben tömegesen megjelenő planktonikus eukarióta szervezetnek köszönhetően. A szervezetet fénymikroszkóppal történő határozás során Prymnesium parvum Carter-nek határoztuk, melynek egyedei 35-40 milliós egyedszámban voltak jelen a merített vízmintában. A merített vízminta töményítés né 1 kül is extrém mértékű toxikológiai eredményeket adott. Víz-toxikológiai tesztek 1. ábra. Hemolitikus teszt véres agaron. a. Prymnesium sejteket nem tartalmazó vízminta, b. Prymnesium parvum sejteket tartalmazó vízminta (lizis foltokkal), c. desztillált víz A teszt alapján felmerült a proteáz hatású anyagok vizsgálata, amelyeket poliakrilamid gélen vizsgáltunk. A Prymnesium nyers fehéijekivonatok (2,5-8 |ig protein/ mintahely) pH: 5,0-n kis mértékű proteáz aktivitást mutattak, éles fehérje-sávokat nem lehetett elkülöníteni. Ezzel szemben lúgos közegben a Prymnesium kivonatok proteáz aktivitása nagyon magas volt, 15 proteáz aktivitással rendelkező enzimet/izoenzimet tudtunk a zselatin tartalmú géleken elkülöníteni. Ezek közül a 100 kDa moltömeg felettiek aránya volt igen nagy (~ 8 enzim/izoenzim sáv). Ezeken kívül nagyon karakteres volt még a 4 proteáz jelenléte (moltömegeik: 90 ± 5; 82 ± 2; 60 ± 2; 46 ± 4 kDa). A 60 ± 2 kDa fehérje gyakran két sávra vált, 3 proteáz sáv (70; 65 ± 2; 40 ± 1) pedig jól csak a 10 %-os géleken volt elválasztható. Az
