Hidrológiai Közlöny 2006 (86. évfolyam)

6. szám - XLVII. Hidrobiológus Napok: Vizeink élővilágát érintő környezeti változások Tihany, 2005. október 5–7.

51 Balatoni planktonikus rákok (Daphnia cucullata, Eudiaptomus gracilis tenyészthető baktérium-partnerei Homonnay Zalán Gábor

1, Kéki Zsuzsa

1, G.-Tóth László

2, Tóth Erika

1 1 Eötvös Loránd Tudományegyetem, Mikrobiológiai Tanszék, Budapest 1117. Pázmány Péter stny. 1/C. 2 MTA Balatoni Limnológiai Kutatóintézet, Tihany 8237. Klebelsberg Kuno út 3. Kivonat: A Balaton két, eltérő táplálkozási planktonikus rákja, a Daphnia cucullata és az Eudiaptomus gracilis valamint a környező víz aerob módon tenyészthető baktérium közösségeit vizsgáltuk. A két rákfaj homogenizátumaiból valamint a Balaton-vízből a következő táptalajokra szélesztettünk: KingB, nutrient, kitin, Cytophaga agar táptalajok, Kidney disease medium, oligotróf táptalaj, pepton-élesztőkivonat agar. A lemezekről random módon baktériumokat izoláltunk, melyek közül a részletes vizsgálatokhoz reprezentatív törzseket szelektáltunk: 541Daphnia, 49/Eudiaptomus és 27/vízminta. A 130 baktériumtörzset membrán zsírsavaik alapján csoportosítottuk, majd a csoportreprezentánsokat és a különálló törzseket 16S rDNS szekvencia analízissel meghatároztuk. Teszteltük a törzsek különböző biopolimer bontó valamint hemolizáló képességét. A vízből és mindkét rákfajból kimutattuk az alábbi baktériumokat: Microbacterium oxydans, Micrococcus luteus, Aeromonas culicicola. Az Exiguobacterium aurantiacum és a Chryseobacterium joostei csak a rákokban fordult elő. A 2 rákminta baktériumközösségeinek eltéréseit első sorban az eltérő aktinobaktérium összetétel és néhány protcobaktérium adja. Csak a vízből mutattuk ki a Brevundimonas, és Rhodococcus nemzetségek képviselőit. A rákokból származó baktériumok 39%-a p-hemolízáló. Kulcsszavak: baktérium, planktonikus rákok, tenyésztés, zsírsavanalízis, szekvencia analízis, patogenitás, Bevezetés A Balaton zooplanktonjának legnagyobb hányadát kitevő rákok kulcsszerepet töltenek be a tó anyag és energia-forgalmában. A közösség döntő részét, akár 80-90%-át az evezőlábú rákok (Copepoda) teszik ki (Zánkai és Ponyi, 1997), amelyek táplálkozása szelektív: a vízből kiválogatják a főként algasejtekből és egysejtűekből álló táplálékukat. A tóban kevesebb, de jelentős mennyiségű ágascsápú rák (Cladocera) él, amelyek tápláléka főleg a detritusz: szűrő táplálkozásuk következménye, hogy a felkeveredő Balatonban béltartalmuk jelentős része emészthetetlen, szervetlen törmelék (G.-Tóth, 2000). A balatoni plankton leggyakoribb Copepoda faja az Eudiaptomus gracilis (Sars 1862), melynek beléből korábban kimutattak baktériumokat is (Muskó 1988), a legjellegzetesebb Cladocera pedig a Daphnia cucullata Sars 1862. Vizsgálataink célja e két, eltérő táplálkozású rákfaj tenyészthető baktériumpartnereinek megismerése volt. Vizsgálati anyag és módszerek A Tihany előtti nyíltvízből 2004. augusztus 18-án vont planktonhálóval élő zooplankton-mintát gyűjtöttünk. Ugyanekkor steril üvegben felszíni vízmintát is vettünk. Sztereomikroszkóp alatt az E. gracilis és a D. cucullata 30-30 aduit példányát kiválogattuk, 5 x 5 ml steril Balaton-vízzel mostuk, majd steril üvegmozsárban homogenizáltuk. A testhomogenizátumokból és a vízmintából 1:10 hígítási sort készítettünk és a hígítási tagokat a következő táptalajokra szélesztettük. A homogenizátumokat King B (

King és mtsai., 1954), KDM-C (Daly és Stevenson, 1985), húskivonat-pepton (Cowan és Steel, 1974), kitin-agar (Reichenbach és Dworkin, 1981), Cytophaga-agar (Pacha és Ordal, 1967); a vízmintát nutrient. King B, Cytophaga-agar, oligotróf táptalaj (Poindexter, 1991). Egy hetes, aerob, 28 °C-on történő inkubációt követően a lemezekről nem szelektív módon baktériumokat izoláltunk, amelyek közül makromorfológiai tulajdonságaik alapján számarányos módon reprezentatív törzseket választottunk ki, 51-et a D. cucullata, 54-et az E. gracilis- és 21-et a vízmintából. Az összesen 130 izolátumot a mikrobiológia szabályainak megfelelően tisztítottuk. A baktériumtörzsekből membrán-zsírsavakat nyertünk ki, azokat észteresítettük (

Stead és mtsai, 1992), majd az így nyert zsírsav-metilészter mintákat HP 5890 gázkromatográfon elválasztva elemeztük (HP1 kapilláris oszlop, BAME [Sigma] standard). A kapott zsírsav-profilok alapján a törzsekkel SYN-TAX 2000 program (Podani 2001) segítségével hierarchikus klaszter-analízist végeztünk (SM koefficiens) A fenon-reprezentatív, valamint a csoportokon kívül eső törzsekből DNS-t izoláltunk (V-gene kit), majd PCR-rel amplifikáltuk a I6S rRNS génjüket (

Rainey és mtsai, 1996). A PCR-termékeket tisztítottuk (Viogene PCR-M™ Clean Up System), majd a Big Dye Terminator Cycle Seqencing kit felhasználásával szekvencia analízist végeztünk. A szekvenciákat ABI 310 Genetic Analyser segítségével analizáltuk, majd a BLAST (

Altschul és mtsai., 1997) segítségével hasonlítottuk össze már ismert szekvenciákkal. A rákokból izolált törzsek következő polimerekre vonatkozó bontási képességét teszteltük: kitin, cellulóz, kazein, zselatin, keményítő, Tween-80. Mint feltételezhető, patogenitási faktort véres agaron vizsgáltuk a rákokból izolált baktériumok hemolizáló képességét is. Eredmények és értékelésük A különböző táptalajok között lényeges eltérést az izolált baktériumok vonatkozásában nem találtunk, jellemző azonban, hogy a kitin-agarról a Promicromonospora sukumoe fajon kívül kizárólag az Exiguobacterium nemzetség tagjait sikerült kitenyésztenünk. Az izolált törzsek egy része a fenntartás során kipusztult, így a D. cucullata mintából 37, az E. gracilis mintából 40, a vízből 21 törzzsel végeztünk részletes vizsgálatokat (1. táblázat). Az 1. ábra a rákokból és a vízmintából származó baktériumok csoportonkénti megoszlását mutatja. Általánosságban elmondható, hogy a planktonikus állatokban változatosabb baktérium-közösséget találtunk, mint a vízmintában: a vízből nem, viszont a rákokból nagy mennyiségben izoláltuk az Exiguobacterium (D. cucullata: 28 %, E. gracilis: 53 %) nemzetség tagjait. Ez a kis G+C tartalmú Gram pozitív nemzetség talajokból, vizekből, ismert baktérium. Törzseink jelentős része az irodalmi adatokkal ellentétben (Jones és Keddie, 1986) kitinbontó képességgel rendelkezik. A kovaalgák sejtjei az E. gracilis táplálékának fontos elemei (G.-Tóth, 2000). Az Exiguobacterium nemzetség tagjai a diatomák felszínén kialakuló változatos biofilmből is ismertek (Makk és mtsai, 2002), ezért lehetséges, hogy a rákot ezen szervezeteken keresztül kolonizálják. Szintén a planktonikus rákok jellemző partnere a Chryseobacterium joostei. Ezt a Flavobacteriaceae családhoz tartozó fajt csak két éve írták le dél-afrikai tejmintákból (

Hugo és mtsai, 2003), természetes habitatját napjainkban kezdik feltárni. A nemzetség tagjai talajokból, vizes élőhelyekről ismertek, pszichrotróf és proteolitikus képviselőik hűtött élelmiszerek romlásáért is felelősek lehetnek. A Chryseobac-