Hidrológiai Közlöny 2000 (80. évfolyam)

5-6. szám - XLI. Hidrobiológus Napok: "Vízi ökoszisztémák (taxonómia, biodíverzitás, biomonitorozás, élőhelyek frakmentációja, inváziós fajok biológiája)" Tihany, 1999 október 6-8.

326 HIDROLÓGIAI KÖZLÖNY 2000. 80. feVF. 5. SZ. Az egy szálú DNS-t bontó nukleázok aktivitásának változása a csírázás folyamán mikrocisztinnel kezelt mustár (,Sinapis alba L.) csíranövényekben M-Hamvas Márta, Molnár Erika, Máthé Csaba, Grigorszky István, Vasas Gábor, Borbély György Kossuth Lajos Tudományegyetem Növénytani Tanszék, 4010. Debrecen, Egyetem tér 1. Kirónál: A fehér mustár (Sinapis alba L ) csiranövény-tesztet alkalmazva adatokat gyűjtöttünk a mikrocisztinek növényekre gyakorolt in vivo hatásairól Azt tapasztaltuk, hogy a mikrocisztin tipikus stresszválaszokat vált ki a növényekben Ezt bizonyítja a mikrocisztinnel kezelt csíranövények növekedésgátlása, a növények morfogenézisében bekövetkező változások, a stresszenzúnek egy csoportjának, az egyszálú DNS-t hasító nukleázoknak az aktivitásemelkedése. Ezen jelenségek idöfílggését vizsgálva a csírázás 0., 2., 4., 6. és 8. napján vett növénymintákat elemeztük. Megállapítottuk, hogy a toxin okozta növekedésgátlás időben is jól nyomon követhető, a csírázás negyedik napján már szignifikáns eltérések figyelhetőek meg a kontroll és a kezelt növénykék növekedési adataiban. A csírázás nyolcadik napján mérhető ssDN-áz aktivitásnövekedés pedig annak az eredménye, hogy a mikrocisztin megzavarja a csírázás folyamatát kísérő természetes ssDN-áz aktivitás változásokat. A csírázás megindulására az ssDN-áz enzimek aktivitásának gyors emelkedése jellemző, a csírázás második napján mérhető a legmagasabb enzimaktivitás. A kontroll növényekben a gyors akti vitásemelkedést gyors akti vitáscsökkenés követi. Az 50 %-os növekedésgátlást elöidéző, vagy annál magasabb mikrocisztin koncentrációval kezelt csíranövényekben az enzimaktivitás csak kis mértékben csökken A csírázás 4., 6. és 8. napján a kontroll aktivitásértékének több, mint kétszerese. Ez a toxinkezelt növények sejtjeiben indukált lebontó folyamatokkal magyarázható. Kulcssz.: Microcystis aeruginosa, mikrocisztin, Blue Green Sinapis Test, nukleáz enzimek, ssDN-ázok. Bevezetés A cianobaktériumok által termelt toxinok egyik legismertebb csoportja a ciklikus heptapeptid szerkezetű hepatotoxinok, az űn. mikrocisztinek (

Falconer és mlsai., 1983). A mikrocisztinek a protein foszfatáz enzimek nagy csoportjára, az űn. PP1 és PP2A típusúakra fejtenek ki gátló hatást, meggátolva ezzel bizonyos foszforilált fehéijék defoszforilációját (MacKintosh és mlsai., 1990). A fehérjék reverzibilis foszforilációja nagyon fontos szabályozó mechanizmus mind az állati, mind a növényi sejtekben (

Smith és Walker, 1996). Kutatásaink célja a mikrocisztinek növényekre gyakorolt in vivo hatásainak alaposabb megismerése. Tesztnövényként a mustárral szemben nagyon érzékeny Sinapis alba csíranövényeket használtuk (Kós és mlsai, 1995). Korábbi vizsgálataink kimutatták, hogy a mikrocisztin a mustár csíranövényekben tipikus stresszválaszokat vált ki (Borbély és mlsai, 1997,- Máthé és mlsai, 1999/ M-Hamvas és mlsai, 1999). Vizsgáltuk a sejtek nukleinsav anyagcseréjében kulcsfontosságú nukleázok közül az egyszálú DNS molekulákat hasító enzimek, az ún. ssDN-ázok aktivitásváltozását. Azt tapasztaltuk, hogy a mikrocisztinnel kezelt nyolc napos csíranövényekben magasabb az ssDN-áz aktivitás, mint a kontroll növényekben (M-Hamvas és mtsai, 1999). Eddigi eredményeink, és a csírázás folyamatát kísérő természetes nukleáz aktivitás változásokra vonatkozó irodalmi adatok ismeretében (Wilson, 1975) arra kerestük a választ, hogy a toxin okozta aktivitás-emelkedés finomított időskálán vizsgálva milyen változások eredménye. Anyag és módszer A vizsgálataink során használt Microcystis aeruginosa törzs az 1991 évi, velencei-tavi vízvirágzásból származó izolátum (BGSD 243, Debrecen Növénytani Tanszék törzsgyűjtemény). Kísérleteinkhez az izolátum tenyészetének nyers kivonatát, valamint a toxintisztítás során nyert mikrocisztin-LR frakciót alkalmaztuk (Kós mtsai., 1995). A kezelések során alkalmazott mikrocisztin mennyiségét nyers kivonat esetében mg klorofill-a ml'

1 táptalaj egységekben, tiszta toxin esetében pedig a frakció 240 nm-en mért abszorpció értékére vonatkoztatva (A

2

4o ml"' táptalaj, e:13,7 cm"

2 mg"

1) adtuk meg (Kós és mtsai., 1995; Borbély és mtsai., 1997). A mikrocisztin növényekre gyakorolt in vivo hatásainak vizsgálatához kísérleti rendszerként a Kós és mtsai. (1995) által kidolgozott axenikus mustár csíranövény-tesztet (BGST; Blue Green Sinapis Test) alkalmaztuk, kisebb módosításokkal (M-Hamvas és mtsai., 1999). A felhasznált vetőmagok ún. „Sárga virágú Szilende" fajták voltak (CIVIS-SEED Kft, Debrecen). Mintát vettünk az elöcsíráztatott magvakból (0 időpont), valamint a kezelés 2., 4., 6., és 8. napján. Megmértük a csíranövények hosszadatait és nedves tömegét, nyers fehéijekivonataikból pedig ssDNáz aktivitást mértünk fotometriás módszerrel és poliakrilamid-gél-elektroforézissel (Laemmli, 1970; Christou és mtsai, 1998). Eredmények és megbeszélésük A fotoperióduson nevelt, nyers kivonattal kezelt csíranövényeken a növekedésgátlás időben is jól nyomon követhető (/. ábra). Az ábrán a csíranövények átlagos nedves tömeg adatait tüntettük fel a mintavételi napok függvényében. A második napon a kezelt, fotoperióduson nevelt növények még ugyan olyan jól fejlettek, mint a kontroll növények, sőt gyakran túl is növik azokat (/. ábra, A). A növekedést serkentő hatást a Microcystis aeruginosa tenyészet nyers toxinkivonatának egyéb szervesanyag tartalmával magyaráztuk. Kis toxinkoncentrációnál (2,5 mg kl-a ml*

1) növekedésgátlás csak a hatodik naptól kezdve figyelhető meg. Nagyobb toxinkoncentrációk esetében a negyedik naptól már megfigyelhető, hogy a toxinkezelt csíranövények növekedése elmarad a kontroll növényekétől. A 20 (ig kl-a ml"

1 toxinmennyiség a fotoperióduson nevelt növényekben körülbelül az ötödik napon, míg az etiolált sorozatban már a negyedik napon 50%-os növekedésgátlást idéz elő. 40 ng kl-a ml"' toxinkoncentráció a negyedik napon már 50% fölötti növekedésgátlást idéz elő. 10 [ig kl-a ml"

1 toxinmennyiség a hatodik napon fejt ki ilyen mértékű növekedésgátlást (Lábra, A és B). Ezt megerősítik az irodalmi adatok, amelyek bizonyítják, hogy a növények akkumulálják a mikrocisztint (Abe és mtsai., 1996; Kurki-Helasmo és Meriluoto, 1998). Hasonló tendenciák figyelhetőek meg a tiszta mikrocisztin-LR-el végzett kezelések eredményeinél is (2. ábra, A és B). Érdekes módon a kis toxinkoncentrációk (0,05 és 0,1 A

24o ml"

1 táptalaj) a második napon még serkentették a növekedést, és ez nem tulajdonítható másnak csak a mikrocisztin hatásának! A negyedik napon az etiolált sorozatban a 0,3 A

24o ml"

1 mikrocisztin-LR már 60%-os, 0,4 A

24o ml'

1 mikrocisztin-LR pedig 66%-os növekedésgátlást idéz elő. A 3. ábra nyers toxinkivonattal kezelt, fotoperióduson nevelt csíranövények ssDN-áz aktivitásának időbeni változását mutatja. A magban még kicsi enzimaktivitás mérhető. A csírázás megindulásával az aktivitás nagyarányú emelkedést mutat. Irodalmi adatok szerint ez időtájt számos új enzim szintetizálódik a mustár csíranövényekben (Frosh és mtsai, 1977; Sharma és Schopf er, 1987; Manga és Sharma, 1990). A kontroll növényekben az ssDNáz aktivitás a magban mért aktivitás több, mint tízszeresére emelkedik, majd a második nap után gyors csökkenést mutat. A hatodik és nyolcadik napon már közel azonos a-