Hidrológiai Közlöny 1999 (79. évfolyam)
4. szám - A Magyar Hidrológiai Társaság XVII. Országos Vándorgyűlése, Miskolc, 1999. július 7–8.
364 HIDROLÓGIAI KÖZLÖNY 1999. 79. ÉVF. 6. SZ. Diatomákhoz asszociált baktériumközösségek dunai kavicsbevonatokban Makk Judit, Kovács Gábor, Márialigeti Károly, Ács Éva ELTE Mikrobiológia Tanszék, 1088. Budapest, Múzeum krt. 4/a. Kivonat: A dunai kavicsok felületéről származó bevonatmintát három különféle algatáptalajra szélesztettük abból a célból, hogy a tenyésztett kovaalgák felületéről a diatomákhoz asszociált baktériumtörzseket izoláljuk. A kovaalgák felszínéről izolált baktériumok közül kulturális-morfológiai bélyegek, néhány biokémiai teszt és ARDRA analízis alapján kiválasztott reprezentatív törzsek genusz ill. faj szintű identiiikálásához a BIOLOG gyors baktériumidentifikációs rendszert és 16S rDNS szekvencia-analízist végeztünk. Eredményeink szerint a Gram-negatív baktériumközösségek tagjai a Pseudomonas, Flavobactertum, Ftavimonas, Aeromonas, Mycoplana, Smorhizobium, Caulobacter, Variovorax, Sphmgomonas, míg a Gram-pozitív a Rhodococcus, Nocardia, Ralhayibacter, Aureobacterium, Microbacterium, Slreplomyces genuszok képviselői voltak. A kovaalgák extracelluláris termékei között eddig olyan szénhidrátokat és aminosavakat mutattak ki, melyeket az általunk izolált baktériumok nagy száma képes értékesíteni. Feltételezhetjük hogy anyagcsere kapcsolatokon alapuló kovaalga-baktérium asszociációk jönnek létre. Kulcsszavak: biofilm, kovaalga-bakténum kapcsolatok 16S rDNS szekvenciaanallzis Bevezetés A biofilmek kitüntetett fontosságúak a folyók és tavak vizeinek öntisztulásában, detoxifikálásában, a vizekben zajló ásványosítási folyamatokban, stb. Ismereteink szerint a fenéküledék mikrobiális közösségeinek anyagcsere aktivitása jelentősen hozzájárul az üledékrétegen átszűrődő víztömegek kémiai-biológiai vízminőségének kialakításához, így e sajátos mikrobaközösségek metabolizmusa erőteljesen befolyásolja ivóvizeink illetve a partiszürésü kutak vízminőségét. Bár a vizekben a mikrobák különböző élőhelyeken figyelhetők meg, jelentős részük mégis élőbevonatokban található. A tavak és folyók fenéküledék bevonataiban nagy mennyiségben előforduló algák, mint producens szervezetek a természetes vizek anyag- és energiaforgalmában elsődleges szerepet töltenek be. Hazánkban bevonatlakó algák legkorábbi vizsgálata Cholnoky nevéhez fűződik, aki a Soroksári-Dunaág perifitikus algáiról közölt adatokat (Cholnoky, 1922) Jelenleg a Duna bevonatlakó algáival Ács és Kiss (1993) foglalkozik, és megállapításuk szerint a perifitikus algák között legnagyobb egyed- és fajszámmal a diatomák fordulnak elő. A kovaalgák jelentős szerepet játszanak az élőbevonatok kialakításában, mindamellett, hogy felületük élőhelyként szolgál sokféle baktérium számára, a természetben anyagcsere-kapcsolatokon alapuló kovaalga-baktérium asszociációk létrejöttét is feltételezhetjük. A Duna felszínvízi, görgetett üledéki és fenéktlledéki baktériumközősségeinek megismerését célzó vizsgálatok többek között az ELTE Mikrobiológiai Tanszékén is folynak. 1990-94-ig tetjedő időszakban vizsgálták a Pozsony-Budapest Duna szakasz nyíltvizének és fenéküledékének aerob és anaerob mikrobiótáját. Eddigi eredményeik alapján megállapítható, hogy a Duna nyílt vizére a GTam-negatív pálca és kokkoidális pálca alakú szervezetek dominanciája jellemző, melyek közül elsősorban a Pseudomonas genuszba tartozó baktériumok tűnnek ki. Ezek mellett a respiratórikus anyagcseréjű Micrococcus-ok jelentősek még. A Duna gyorsfolyású szakaszának görgetett üledéki mikrobiótájában a GTam-pozitív mikrobák között főként aerob légző szervezetek találhatók, amelyek tipikus sejtmorfológiájuk alapján a korineform csoport, elsősorban az Arlhrobacter genusz egyes képviselői. Viszonylag gyakori a Micrococcus nemzetség egy tagja, valamint a Gram-negatív csoportok néhány reprezentánsa is. A finomszemcsés üledékben viszont a Gram-negatív szervezetek dominálnak elsősorban Aeromonas-ók. Csekélyebb számban a Gram-pozitív kokkuszok, illetve a korineformok is jelen vannak. A görgetett üledék bevonatával ellentétben a finomszemcsés üledékben a fakultatív légzők arányának növekedése állapítható meg (Zalmum és Márialigeti, 1995). 1994-95 között a BudapestVisegrád Duna szakaszon, a kisoroszi parti szűrésű kutak térségében vizsgálták a görgetett üledék élóbevonata mikrobapopulációjának faji összetételét hagyományos élettani, biokémiai tesztek és 16S rDNS szekvencia-analízis segítségével. Eredményeik szerint a Gram-negatív heterotróf bevonatközösségek domináns tagjai a "Pseudomonas" nemzetség képviselői, valamint a fakultatív metilotróf, illetve Hj autotróf Hydrogénomonas, Xanthomonas, Xanthobacter nemzetségek tagjai. Nyáron a meleg és hipertóf vizekben az Aeromonas genusz több faja is kimutatható. A Gram-pozitív közösségekben korineform szervezetek, főleg a Rhodococcus fajok dominálnak. A kimutatható fajok száma korrelációt mutat a vízállással. Magas víznél jóval több faj fordul elő és megjelennek a H 2autotrófok is. Molekuláris módszerekkel (16S rDNS szekvenálás) egy új Hyphomicrobium faj mellett a Nitrobacter nemzetség egy feltehetően új képviselőjét is megtalálták. A nitrifikálók egyértelmű szerepének tulajdonítják hogy bár a Dunavlz gyakran tartalmaz ammóniát, a kútvízben ez a szennyeződés gyakorlatilag sosem jelenik meg (Márialigeti és mtsai, 1997). Vizsgálati anyag és módszerek Mintavétel 1996 június 8-án a Duna főágában, az 1684,5 fkm-nél a Szentendrei-sziget észak-keleti részén, a Kisoroszi I. kút térségében történt. A Budapest ivóvízellátása szempontjából fontos partiszürésü kutak jelentős része ezen a partszakaszon található. Ezen a napon a Duna vízáramlási sebessége 2674 m 3 s"' és hőmérséklete 19,9 °C volt. A mintavétel Ekman-Birge-féle üledék mintavevővel történt mintegy 80-100 cm-es mélységből A mintavevő készülékből a kavicsok steril csipesszel való kiemelése után a rajtuk kialakult bevonatot steril ecsettel, N-tlpusú alga-tápsóoldatha mostuk (Droop, 1969). Ezenkívül elektronmikroszkópos vizsgálatok céljából ugyanebből a mélységből steril tápsóoldatba kavicsokat gyűjtöttünk. Ezt követően a mintákat lehűtött állapotban laboratóriumba szállítottuk. A gyűjtött bevonatmintákból steril desztillált víz felhasználásával 5 tagú hígítási sorozatot készítettünk, majd ezek különböző fokozataiból az alábbi összetételű algatenyésztő táptalajokra szélesztettünk: N-típusú, Hughes által módosított Allen-féle táptalaj, C-típusú, Schlösser által módosított "Bacillariophyceen Médium", B-típusú, Beakes és Jaworski által módosított diatoma táptalaj (Droop, 1969, Schlösser, 1968, Thompson, 1988). Az egy hónapig szobahőmérsékleten, szórt fényben történő inkubációs idő lejárta után kiválasztottuk a háromféle táp-agarlemez közül azokat, amelyeken a diatomák növekedése legintenzívebbnek tűnt. A kiválasztott táp-agarlemezek felületéről származó mintákat a kovaalgákhoz asszociált baktériumok kitenyésztése céljából húspepton és éiesztős húspepton táptalajokra szélesztettük. Első lépésben kulturálismorfológiai bélyegek alapján, illetve néhány biokémiai-fiziológiai teszt (kataláz és oxidáz teszt, glükóz oxidatív és fermentatív bontása, metilvörös és Voges-Proskauer reakció, nitrát redukció, ureáz aktivitás, kénhidrogén képzés, mozgásképesség vizsgálata) és ARDRA analízis (Massol-Deya és mtsai, 1995) eredményeinek figyelembevételével az izolátumok között reprezentatív törzseket különítettünk el. A reprezentatív törzsek genusz illetve faj szerinti meghatározásához a BIOLOG baktérium identifikációs módszert és 16S rDNS szekvencia összehasonlító elemzését alkalmaztuk. A baktériumok fajleírását a Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (Holt, 1994) alapján végeztük. A mintákból H2O2-OS roncsolás után elkészített tartós preparátumból fáziskontraszt fénymikroszkóp és elektronmikroszkóp segítségével határoztuk meg a kovaalgákat (Krammer és Lange-Bertalot, 19771991). A bevonat-mintából származó roncsolt minta kovaalgáit 500 valváig, a tenyészetből származó kovaalgákat pedig 100 valváig számoltuk (Makk és Ács, 1997). A scanning elektronmikroszkópia (SEM) a kavicsfelület mikrobaközösségeinek, illetve kovaalgatenyészetek felszíni tanulmányozására alkalmas. A kémiai minta-előkészítés során a kovaalga tenyészetekből kivágott kb. 0,5 cm 2-es agar kockákat, valamint az eredeti kavicsokat 5 %-os glutáraldehidbe helyezve rögzítettük. Foszfát-pufferes mosás után aceton hígítási sorozatban víztelenítettünk majd a kritikus ponton kiszárított mintákat a SEM vizsgálat előtt arannyal gőzöltük be.
