Fogorvosi szemle, 2016 (109. évfolyam, 1-4. szám)
2016-03-01 / 1. szám
32 FOGORVOSI SZEMLE ■ 109. évf. 1. sz. 2016. 3. ábra: A leválogatott sejtek karakterizálása és osteoblast irányú differenciáltatása. A-D) Leválogatott sejtek immunofluoreszcens festés után. Sejtmag (A), a-CD44 (B), a-STRO-1 (C), egyesített (D). E-F) A sejtközötti állományban a kalcium lerakódást kimutató Alizarin Red festés tenyésztőmédiumban (E) és differenciáltató médiumban (F) 3 hétig tenyésztett sejteken. A pozitív festődés osteoblast irányú differenciációra utal. a következőképpen alakult: MACS 79,53 ± 5,78%, FACS 88,27 ± 3,70%, MACS-FACS 98,43 ± 0,67% (2. ábra B-E). A MACS és FACS válogatott mintákban az őssejt-feldúsulások közötti különbség nem szignifikáns (p > 0,05), míg a MACS-FACS válogatás során szignifikánsan nagyobb mértékben búsultak föl az őssejtek a sejtpopulációban a MACS-hoz és a FACS- hoz képest is (p > 0,05). Míg a mágneses válogatásból nyert sejtek száma egy héttel a válogatás után több mint négyszeresére nőtt, ugyanezen idő alatt a citométeres válogatásból nyerteké csak alig duplájára, de nem szignifikánsan nőtt (p > 0,05), míg a MACSFACS válogatásból származóké szignifikánsan csökkent (p > 0,05) (2. ábra A). A FACS tehát valamelyest nagyobb tisztaságú sejtpopulációt eredményez, különösen MACS-szel kombinálva, viszont a válogatás utáni sejtpopuláció kisebb és lassabban vagy egyáltalán nem indul növekedésnek. A leválogatott sejtek tulajdonságai A mezenchimális őssejt markerek elleni ellenanyagokkal (a-STRO-1, a-CD44) festődtek a sejtek (3. ábra A-D), míg a negatív kontrollként használt, haematopoietikus őssejtekre specifikus a-CD14 és a-CD19 ellenanyagokkal nem. A válogatott sejtpopuláció osteoblast irányú differenciálódási képességét háromhetes kezelés után vizsgálva azt tapasztaltuk, hogy a tenyésztőmédiumban tartott sejttenyészetek nem, míg a differenciáltató médiumban tartott sejttenyészetek festődtek Alizarin Reddel (3. ábra E-F). Megbeszélés Tulajdonságaik vizsgálatához az őssejteket el kell különíteni a szöveti sejtektől. A szakirodalomban változatos módszereket alkalmaznak: szeparálják a sejteket sűrűség, méret és morfológia, valamint kolonizációs képesség alapján, ám ezek a módszerek sokszor nem alkalmazhatók kellő hatékonysággal és megbízhatósággal. A sejtfelszíni fehérjék között vannak olyanok, amelyek csak bizonyos sejttípusokra jellemzőek, így vannak őssejt-specifikus sejtfelszíni markerek is. Ezek alapján általában nagy hatékonysággal és megbízható pontosságban lehet az őssejteket elkülöníteni: FACS- szel körülbelül 95% tisztaságú, MACS-szel körülbelül 75% tisztaságú sejtpopulációt lehet elérni. Ugyanakkor MACS-szel nagyságrendekkel több sejtet lehet azonos idő alatt leválogatni, mint FACS-szel (~1011, illetve 107 sejt óránként) [17]. A MACS nemcsak gyorsabb, hanem egyszerűbb és olcsóbb eljárás, nem igényel drága műszert, hordozható, ezért gyakorlatilag bárhol használható, ahol a sejtek számára szükséges steril körülményeket biztosítani lehet. Hátránya ugyanakkor, hogy csak sejtfelszíni fehérjék alapján lehet válogatni vele [6]. Arra is vannak adatok a szakirodalomban, hogy a válogatás hatékonysága függhet a sejtek származási helyétől és típusától, a választott sejtfelszíni markertől, illetve annak expressziós intenzitásától [5, 15, 16]. Munkánkban összehasonlítottuk a két módszert az általunk használt sejteken. A mágneses válogatáshoz jelölt sejteket fluoreszcensen is megjelöltük, egyrészt hogy meg tudjuk mérni a mágneses válogatás hatékonyságát, másrészt hogy megvizsgáljuk, javítja-e a két módszer kombinálása (MACS-FACS) a külön-külön alkalmazott módszerek hatékonyságát. Eredményeink azt mutatják, hogy az őssejtek feldúsulása a sejtpopulációban csaknem olyan hatékony MACS-szel (79,53 ± 5,78%), mint FACS-szel (88,27 ± 3,70%), a mágneses válogatás hatékonysága nem szignifikánsan gyengébb a FACS-nél. Háromszor megismételt méréseink eredményei azt mutatják, hogy FACS technikával történt válogatás után a populációnövekedés szignifikánsan és jelentősen gyengébb, mint MACS-szel történő szeparálás után. Ezzel ellentétben a két módszer kombinálása nem hatékony, mert az így leválogatott sejtpopulációk már nagyon kicsik, és az általunk vizsgált időszak alatt nemhogy nem indult meg a növekedésük, hanem még
