Fogorvosi szemle, 2015 (108. évfolyam, 1-4. szám)
2015-09-01 / 3. szám
101 FOGORVOSI SZEMLE ■ 108. évf. 3. sz. 2015. gyítású objektíwel mozaik scan módban végeztük. A mérések és a kiértékelések iCys 3.4 szoftverrel történtek Windows XP operációs rendszer alatt futtatva. Sejtek proliferációjának mérése LSC-vel mért összterület alapján Steril körülmények között hatlyukú plate 1-1 well-jébe 20000 HEPM sejtet (ATCC No.: CRL-1486) helyeztünk középre csepegtetve. Egy kontroll és egy 1 pg/ml BMP-2- vel (Antibodies-online GmbH; Z00327) kezelt mintát vizsgáltunk. 3 napos 37 BC-on történő inkubálást követően 2 ml EMEM medium (ATCC: 30-2003) és 0,5 ml 20 pg/ml FDA (Life Technologies; F1303) oldatban 30 percig jelöltük, majd mostuk a sejteket kétszer 3 ml EMEM médiumban (ATCC: 30-2003) és LSC-vel mértük a sejtek összterületét. Mérés után a kezelt sejtekhez 3 pl 1 mg/ml BMP-2-t (Antibodies-online GmbH; Z00327) raktunk. 48 óránkét mértük a sejtek összterületét 9 napig nyomon követve, minden mérés után friss BMP-2 (Antibodies-online GmbH; Z00327) került a sejtekre, majd a BMP-2 (Antibodies-online GmbH; Z00327) kezelést abbahagyva további 8 napig vizsgáltuk a sejtek proliferációját. Alamar blue assay Steril körülmények között 96 lyukú plate 1-1 well-jébe 5000 HEPM sejtet (ATCC No.: CRL-1486) helyeztünk. 24 órás 5% Co2-ban 37 eC-on történő inkubálás után a letapadást követően mostuk a sejteket színtelen EMEM (Sigma Aldrich; M4144) tápfolyadékkal, majd 100 pl, színtelen EMEM (Sigma Aldrich; M4144) tápfolyadékban 10x-re hígított Alamar blue reagenssel (Life Technologies; DAL 1100) történő 4 órás inkubációt követően Synergy HT plate reader (Bio Tek) készülékkel mértük a mintákat, fluoreszcens módban, 530 nm hullámhoszszúságú fénnyel gerjesztve, 590 nm hullámhosszon detektálva. Mérés után eltávolítottuk a redukált Alamar blue reagenst, majd különböző koncentrációjú (0,001 pg/ml, 0,01 pg/ml, 0,1 pg/ml, 1 pg/ml) BMP-2-vel (Antibodiesonline GmbH; Z00327) kiegészített friss EMEM médiumban (ATCC: 30-2003) inkubálva kétnaponta megismételtük a mérést. Immun fluoreszcens jelölés Készítettünk egy kezeletlen kontroll és egy 1 pg/ml BMP-2-t (Antibodies-online GmbH; Z00327) tartalmazó mintát. 24000 sejtet helyeztünk nyolclyukú sejttenyésztő kamra egy-egy well-jébe. Háromnapos 37 eC-on történő inkubálást követően mostuk a sejteket háromszor három percig fosz/af-pufferelt fiziológiás sóoldattal (1x PBS, phosphate-buffered saline, Sigma Aldrich; PBS1), majd fixáltuk és permeabilizáltuk a mintákat két percig 200 pl acetonnal (Sigma Aldrich; 650501). Ezt követően ismét mostuk a sejteket 1x PBS-ben (Sigma Aldrich; PBS1), majd jelöltük a mintákat harminc percig 4 pg/ml Fitc phalloidint (aktin filament-zöld) (Life Technologies; A12379), 20 pg/ml Propidium jodidot (sejtmag-piros) (Life Technologies; P3566), tartalmazó 1xPBS-sel (Sigma Aldrich; PBS1), mely tartalmazott 1% BSA-t (Sigma Aldrich; A2153). Mostuk a sejteket 5 mM-os EDTA-t tartalmazó PBS-sel. A mintákat 5 mM-os EDTA-t (Sigma Aldrich; E6758) tartalmazó 1xPBS (Sigma Aldrich; PBS1) és antifade (Life Technologies; P36930) elegyében tároltuk, majd konfokális mikroszkóppal készítettünk képet a mintákról. Konfokális mikroszkóp A mikroszkópos felvételeket Zeiss LSM510 típusú konfokális mikroszkóppal készítettük. A fluoreszceinnel jelölt falloidint (Life Technologies; A12379) 488 nm hullámhosszúságú, argon lézerrel előállított fénnyel gerjesztettük és az emittált fluoreszcens fényt BP500-530 filteren keresztül detektáltuk. A propidium jodidot (Life Technologies; P3566) 543 nm hullámhosszúságú, HeNe lézerrel előállított fénnyel gerjesztettük és az emittált fluoreszcens fényt BP560-615 filteren keresztül detektáltuk. A minták vizsgálatához C-Apochromat 40x/1,20 W Korr UV-VIS-IR objektívet alkalmaztunk. Statisztikai analízis Kapott eredményeink statisztikai elemzéséhez ANOVA-t és Bonferroni post hoc tesztet alkalmaztunk. Szignifikánsnak a p < 0,05 különbséget tekintettük. Adatainkat átlag ± SD (szórás) ábrázoltuk. Az ábrákon a csillaggal jelölt értékek a kontrolihoz viszonyított statisztikailag szignifikáns különbségeket jelölnek. Eredmények Kísérleteinkben a BMP-2 homodimer rövid távú hatását vizsgáltuk háromnapos (72 órás) kezelést követő morfológiai, valamint proliferációs vizsgálatokkal. A morfológiai mérések során három paramétert vizsgáltunk: terület, kerület, valamint cirkularitás. A nem letapadt HEPM sejtek morfológiája kerek, míg a már letapadt sejtek fibroblasthoz hasonló elnyújtott alakúak, hosszú nyúlványokat növesztenek, így a letapadás során mindhárom vizsgált paraméter megnő. (2. ábra) A méréshez elengedhetetlen, hogy a sejtek különálló módon helyezkedjenek el és ne konfluensen. A háromnapos BMP- 2 kezelést követően ezért a sejteket szétválasztottuk 2. ábra: LSC-vel végzett morfológiai vizsgálat szkennelési területeiről készült egy-egy reprezentatív mikroszkópos felvétel.
