Fogorvosi szemle, 2015 (108. évfolyam, 1-4. szám)

2015-09-01 / 3. szám

102

FOGORVOSI SZEMLE ■ 108. évf. 3. sz. 2015.

3. ábra: BMP-2 koncentrációsorral 72 óráig kezelt HEPM sejtek letapadásának és morfológiájának vizsgálata LSC-vel.

Az oszlopdiagramokon a három jellemző morfológiai paraméter három független kísérletben történt mérésének átlaga és szórása (SD) van ábrázolva: (A) terület, (B) kerület, (C) cirkularitás.

egymástól és a felületről, és megfelelően kis koncentrációban, hogy citométerrel kontúrozni tudjuk az egyedi sejteket, újra letapasztottuk. A letapadás során továbbra is fenntartottuk a BMP-2 kezelést, valamint LSC-vel monitoroztuk a letapadási folyamat során változó sejtmorfológiát. 4 óra elteltével kezdeti letapadás volt tapasztalható, ahol a BMP-2 koncentrációjával korrelálva mindhárom morfológiai paraméter növekedést mutatott. Három független kísérletet elvégezve 0,1 pg/ml BMP-2 koncentrációnál a terület és kerület esetén a növekedés statisztikailag szignifikánsnak bizonyult (statisztikai tesztben számolt p értékek: p (terület) = 0,039; p (kerület) = 0,015), amiből arra következtethetünk, hogy a BMP-2-vel kezelt HEPM sejtek hamarabb kezdtek letapadni, mint a kezeletlen kontrollsejtek. 24, illetve 72 órás inkubációt követően a letapadás fokozatosan teljessé vált, a sejtek elérték végleges morfológiájukat, ahol cirkularitásuk, területük és kerületük nem mutatott különbséget. A teljes letapadást jelentő 72 óra elteltével minden BMP-2 koncentrációnál hasonló értékeket mértünk mindhárom paraméter esetén, ezért azt a következtetést vontuk le, hogy a BMP-2 kezelés nem volt hatással a sejtek végleges morfológiájára. (3. ábra) További kísérletben konfluens sejtkultúrában is megvizsgáltuk a sejtek morfológiáját a legnagyobb, 1 pg/ml BMP-2 koncentrációnál. Háromnapos kezelést követően a közvetlenül a sejtmembrán alatt lokalizálódó aktin filamentumok direkt fluoreszcens jelölésével láthatóvá téve a sejtek alakját, konfokális mikroszkóppal hasonlítottuk össze a kontroll és kezelt sejteket. Az előzőekhez hasonlóan nem találtunk különbséget a sejtek morfológiájában. (4. ábra)

A proliferáció vizsgálatához két módszert alkalmaztunk. Az egyik módszer egy általánosan alkalmazott, úgynevezett Alamar blue assay, ami az élő sejtek mitokondriumában lejátszódó redukciós reakción alapul, a másik egy lézer pásztázó citometián alapuló saját metodika. Ez utóbbi esetben a sejteket úgy helyeztük a sejttenyésztő plate-be, hogy azok együtt maradjanak egy foltban, majd a letapadást követően ennek a foltnak a nagyságát monitoroztuk LSC-vel több napon keresztül, FDA festéssel téve láthatóvá az élő sejteket. Az összterület meghatározása az LSC szoftverével történt, amely minden olyan eseményt körbekontúroz, amely-FITC - Falloidin (F-aktin)

Propidium -jodid (sejtmag)

kontroll BMP-2 kezelés után (1 pg/ml)

4. ábra: HEPM sejtek morfológiája Fitc-falloidin (aktin filament-zöld) és propidium jodid (sejtmag-piros) jelölést követően, konfokális mikroszkóppal vizsgálva.

A bal oldali képen kezeletlen sejtek, a jobb oldali képen az 1 pg/ml BMP-2-vel kezelt sejtek morfológiája látható. A sejtmembrán alatt lokalizálódó aktin filamentumok követik a sejt alakját, ami nem változott a BMP-2 kezelés hatására.