Fogorvosi szemle, 2015 (108. évfolyam, 1-4. szám)
2015-09-01 / 3. szám
100 FOGORVOSI SZEMLE ■ 108. évf. 3. sz. 2015. 1. ábra: BMP szignáltranszdukciós útvonalak. (Bessa PC, Casal M, Reis RL: Bone Morphogenetic Proteins in Tissue Engineering: the Road from Laboratory to Clinic, Part I /basic concepts/. J. Tissue Eng. Regen. Med. 2008: 1-13.) A kísérleteinkben használt BMP-2 a csontképződés során a differenciálódó osteoblastokban indukálja a Cbfal (Runx-2) gén expresszióját, amely transzkripciós faktorként kötődik további gének promótereihez, aktiválva azok expresszióját. Ilyen gének például az osteopontin, osteonectin, osteocalcin, kollagén I, csont szialoprotein, melyek differenciált osteoblast sejtekben termelődnek és szekretálódnak, kialakítva a csontszövet extracelluláris mátrixát, továbbá megkötik a kálciumot, illetve a hidroxiapatitot, így szerepet játszanak a csontszövet mineralizációjában. Az irodalomban fellelhető adatok alapján a BMP-2 in vitro és in vivo is alkalmas csontfejlődés, valamint csontregeneráció indukálására, ezért klinikai alkalmazásában számos területen, így a fogászati implantációban is nagy lehetőségek rejlenek. A fogorvosi gyakorlatban alkalmazott titán bioaktív molekulákkal való módosításának legegyszerűbb módja ezen molekuláknak a fém felszínen történő adszorpciója, ami történhet kezeletlen felszínen, felületi érdesítéssel porózussá tett titán felszínen [6, 7], vagy titán bevonására alkalmas porózus anyagok (ß-trikälcium-foszfät, hidroxiapatit) felszínén [1, 17], Az adszorbcióval felvitt különböző molekulák a porozitás függvényében rövid idő alatt (~3 nap) kidiffundálnak a környező szövetekbe [1,6, 7, 17], Ilyen módon a BMP-2 homodimer fogászati titán implantátumokon történő adszorpciója egy nagyon egyszerű és gyors módja lehetne a titánfelszín csontképződést elősegítő molekulával történő módosításának. Célkitűzésünk ezért a BMP-2 homodimer fehérjével történő kezelés rövidtávú hatásainak vizsgálata humán embrionális szájpadlásból származó mesenchyma sejteken (HEPM). Ennek érdekében vizsgálni kívántuk BMP-2 homodimer fehérjék hatását a sejtek differenciációjára, hangsúlyozottan azok morfológiájára, valamint proliferációjára. Anyagok és módszerek Sejtek tenyésztése HEPM (ATCC No.: CRL-1486) sejtek tenyésztése Eagleféle minimum esszenciális tápfolyadékban (EMEM) történt, kiegészítve 0,1 mM nem esszenciális aminosavakkal, 1mM Na-piruváttal, (ATCC: 30-2003), 10% hő által inaktivált fötális borjúszérummal (FBS, Sigma Aldrich; F9665), 1% L-glutaminnal (Sigma Aldrich; G3126) és 0,125% gentamycinnel (Chinoin; 3587/01), standard tenyésztési körülmények között 37°C hőmérsékletű, 5%-os C02 és magas páratartalmú légkört biztosító inkubátorban tartott 25 cm2 területű szövettenyésztő flaskábán. BMP-2 homodimer törzsoldat Az 1 mg liofilizált BMP-2 homodimert feloldottuk (Antibodies-online GmbH; Z00327) 1 ml, 20 mM steril ecetsav (Sigma Aldrich; 320099) 0,1% borjúszérum albumin (BSA, Sigma Aldrich; A2153) oldatban, majd 10 pl-es aliquotokban tároltuk -80°C-on felhasználásig. Sejtek letapadásának és morfológiai változásának meghatározása 72 órás, különböző koncentrációjú (0,001 pg/ml, 0,01 pg/ml, 0,1 pg/ml, 1 pg/ml) BMP-2-vel (Antibodies-online GmbH; Z00327), 25 cm2 területű sejttenyésztő flaskában történő kezelést követően, 0,05%-os tripszin-etilén-diamin-tetraecetsav (tripszin-EDTA, Sigma Aldrich; T-4799) oldattal kezeltük a konfluens sejtkultúrát. EMEM tápfolyadékkal (ATCC: 30-2003) leállítottuk a tripszines emésztést, 5 perces 1200 rpm-en történő centrifugálást követően tápfolyadékban felvéve a sejteket Bürker-kamrával, fénymikroszkóp segítségével meghatároztuk a sejtek számát. 5000 sejtet helyeztünk nyolclyukú sejttenyésztő kamrába (Ibidi; 80826), megfelelő mennyiségű (0,001 pg/ml, 0,01 pg/ml, 0,1 pg/ml, 1 pg/ml) BMP-2 homodimerrel (Antibodies-online GmbH; Z00327) kiegészített tápfolyadékban. 4, 24 és 72 órán át 37 QC-on inkubálva hagytuk a sejteket letapadni. Ezután 20 pg/ml fluoreszcein diacetát (FDA, Life Technologies; F1303) oldattal 30 percig jelöltük 37 sC-on a sejteket. Ezt követően háromszor mostuk tápfolyadékkal és lézer pásztázó citometriás módszerrel mértük a sejtek morfológiai paramétereit: kerület, terület, cirkularitás. Ezek közül az utóbbi faktor (melyet az előző kettőből számolhatunk) cirkularitás = (kerület2/terület) jellemzi leginkább a sejtek alakját. Minél nagyobb ez a szám, a sejtek annál nyújtottabbak. Lézer pásztázó citometria (LSC) A citometriás méréseket iCys Laser Scanning Cytometerrel (CompuCyte) végeztük. Az FDA (Life Technologies; F1303) gerjesztéséhez argon-ion lézerrel generált 488 nm hullámhosszúságú fényt használtunk. A gerjesztés hatására emittált fluoreszcens fényt zöld csatornában 530 nm-en átengedő filteren keresztül detektáltuk. A morfológiai méréseket 20x nagyítású objektívvei normál scan módban, a proliferációs méréseket 10x na
