Fogorvosi szemle, 2014 (107. évfolyam, 1-4. szám)
2014-06-01 / 2. szám
44 FOGORVOSI SZEMLE ■ 107. évf. 2. sz. 2014. differenciáltatási és felhasználási iránya az oszteogén irány. Megfelelő farmakológiai indukcióra válaszolva az emberi fogból származó MSC-k valóban differenciáltathatók in vitro körülmények között oszteogén/odontogén irányba. Az ilyen módon kapott sejtek polarizált sejttesttel rendelkeznek és kalcium-tartalmú mineralizációs csomókat halmoznak fel [11, 15, 16, 18, 26, 27, 29], A humán fogeredetű őssejtekkel végzett kutatásaink folytatásaként most a patkány metszőfogakból izolált sejtkultúrák vizsgálatával kapcsolatos legújabb eredményeinkről számolunk be. Kísérleteink elsődleges célja az volt, hogy patkányok alsó metszőfogának pulpaszövetéből olyan primer sejttenyészetet hozzunk létre, amely őssejt (vagy progenitor sejt) tulajdonsággal rendelkező sejteket tartalmaz. Továbbá célul tűztük ki a sejtkultúrák in vitro differenciáltatását oszteogén és neurogén irányba. Ezenkívül a korábbinál hatékonyabb neurogén differenciációs protokollt kívántunk kifejleszteni a tenyésztőedények előzetes felületkezelése révén. Vizsgálati anyag és módszerek Sejtizolálás és sejttenyésztés Hím Wistar patkányok (120-180 g) mandibulájának eltávolítása után a mandibula bázisát feltárva nyertük ki a pulpaszövetet az alsó metszőfogakból, majd azonnal steril PBS-be (Gibco) helyeztük. Az őssejtek izolálását a kutatócsoportunk által humán őssejtek esetében korábban publikált módszer [15, 16, 27] kisebb módosításával végeztük. A pulpaszövetet óraüvegen steril körülmények között szikével felaprítottuk, majd a kollagenáz I enzim (Sigma) 1 mg/ml-es koncentrációjú oldatában emésztettük 1 órán át 37° C-on, és közben 10 percenként vortexeltünk. Az emésztett szövetdarabokat 250 gvel 5 percig centrifugáltuk, a felülúszót eltávolítottuk, és a sejteket tápoldattal a tenyésztőedénybe mostuk. 100 U/ml penicillint és 100 pg/ml streptomycint (Sigma), valamint 2 mM L-glutamint (Sigma) tartalmazó aMEM (Gibco) tápoldatban tenyésztettük az izolált sejteket 10%-os FBS (fetal bovine serum, Gibco) koncentráció mellett. Hetente kétszer cseréltük a tápoldatot, és hetente egyszer passzáltuk a tenyészeteket 0,05% tripszin-EDTA (Gibco) oldat segítségével. A sejteket standard körülmények között 37 °C hőmérsékleten, 5%-os C02-tartalmú levegőn tenyésztettük. Sejtproiiferáció vizsgálata WST-1 teszttel A sejtproiiferáció vizsgálatát egy korábban leírt protokoll [16] alapján végeztük, csak a hagyományos MTT- teszt helyett a nagyobb érzékenységű WST-1 tesztet alkalmaztuk. A 96 lyukú szövettenyésztő tálka üregeibe kiültetett sejtekről másnap a tenyésztő médiumot eltávol ítottuk, helyette szérummentes tápoldatot adtunk a sejtekhez a tenyészetek szinkronizálása céljából. A szérummentes tápoldatot 24 óra elteltével különböző szérumtartalmúra cseréltük, majd újabb 24 óra elteltével vizsgáltuk a sejtek életképességét a vízoldékony tetrazóliumsót tartalmazó WST-1 (4-[3-(4-iodofenil)-2- (4-nitrofenil)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene diszulfonát) reagens (Roche) segítségével. A 2 órás inkubációt követően a minták abszorbanciáját 450 nm hullámhoszszon mértük le, 655 nm referencia hullámhossz mellett. Oszteogén irányú differenciáltatás Az oszteogén irányú differenciálódást az irodalomban már leírt módon váltottuk ki [15-17]. Az indukciós médium a tenyésztő tápoldathoz hasonlóan 100 U/ml penicillint és 100 pg/ml streptomycint, valamint 2 mM L-glutamint tartalmazott, viszont csak 1% szérumot (FBS). Emellett az pMEM médium még 10~8 M dexametazonnal, 50 pg/ml L-aszkorbinsav-2-foszfáttal és 10 mM ß-glicerofoszfáttal is ki lett egészítve. Ebben az oszteogén médiumban tenyésztettük a sejteket 3 héten át passzálás nélkül, miközben hetente kétszer tápcserét végeztünk. A 3. hét végén a kalcium-vegyületek lerakódását kimutató Kóssa festéssel (a nemzetközi irodalomban von Kossá festésként ismert a magyar kutató által kifejlesztett módszer) [19], valamint alizarinvörös festéssel azonosítottuk a mineralizációs gócokat. Neurogén irányú differenciáltatás A már korábban publikált háromlépéses protokollunk felhasználásával indukáltuk a sejtek neurogén differenciálódását [18], A DPSC-k kiültetéséhez használt DMEM/F12 (Gibco) tápoldatot 2,5% FBS-sel (Gibco), 100 U/ml penicillinnel és 100 mg/ml streptomycinnel (Sigma) egészítettük ki. A kiültetést követő napon a fenti médiumot lecseréltük 2,5% FBS-t, 10 ng/ml bFGF-et (Sigma) és 10 pM 5-azacitidint (Sigma) tartalmazó DMEM/F12 tápoldatra, amiben a differenciádé első lépéseként 48 órán keresztül inkubáltuk a sejteket. PBS-sel történő mosást követően a második, vagyis indukciós fázisban 72 órán át DMEM/F12 médiumban tenyésztettük a sejteket 250 pM IBMX (Sigma), 50 pM Forskolin (Sigma), 1 mM db cAMP, 0,2 pM TPA (Sigma), 10 ng/ml bFGF, 10 ng/ml NGF (Sigma), 1 mM dbcAMP (Sigma), 30 ng/ml NT-3 (Sigma) és 1% ITS (Sigma) hozzáadásával. Az érési fázisban 3-10 napig 1 mM dbcAMP, 1% N2, 1% B27, és 30 ng/ml NT-3 tartalmú Neurobasal A médiumban tartottuk a sejteket. Neurogén differenciációs protokoll módosítása Az intenzívebb proliferáció elősegítésére a tenyésztő tápoldatba az izolálástól fogva 10 ng/ml bFGF-et is tettünk. A neurogén differenciáltatás második fázisából kihagytuk a dbcAMP-t, továbbá a harmadik (érési) fázist kettébontottuk az Arthur és munkatársai áItal publikált protokoll [2] szerint. Az érés első hetében a DMEM/F12 médium az antibiotikumok mellett 1% ITS-t és 40 ng/ml bFGF-et tartalmazott, míg a második héten ezt még 50 nM retinsawal is kiegészítettük. A tápoldatot hetente kétszer cseréltük. Felületkezelés Mivel az irodalomban a neurogén differenciáltatás során számos különféle felületen tenyésztik a sejteket,
