Fogorvosi szemle, 2014 (107. évfolyam, 1-4. szám)
2014-06-01 / 2. szám
45 FOGORVOSI SZEMLE ■ 107. évf. 2. sz. 2014. a patkány pulpa sejtjeink számára kerestünk alkalmas felületet neurogén differenciálódáshoz hat különböző felület alkalmazásával. Korábbi protokollunk szerint [18] a poly-L-lizin (PLL, Sigma) kezelést 15 percen át szobahőn, a lamininnel történő kezelést (LA, Sigma, 5 pg/ml) pedig 2 órán át 37°C-on végeztük. Ezenkívül PLL és LA kombinációjával (LILA) [32] valamint ornitin (Sigma) és laminin kombinációjával (ORLA, ornitin 10 pg/ml, 1 óra inkubáció) [2] is kezeltük a tenyésztőedények felületét. Mindezek mellett az FBS-sel történő előkezelés (30 percen át, 37°C-on) hatását is megvizsgáltuk, kontrollként pedig NTC-n („non tissue culture”), vagyis kezeletlen felületen differenciáltattuk a sejteket. Immuncitokémiai vizsgálatok Az immuncitokémiai festéshez a 8 kamrás tárgylemezen (8 chamber slide, Lab-Tek) tenyésztett sejteket 20 percig fixáltuk szobahőmérsékleten paraformaldehid (PFA, Sigma) 4%-os oldatában. Ezután 0,1% Triton X-et (Reanal) tartalmazó PBS-sel permeabilizáltuk a sejtek plazmamembránját és 5%-os kecskeszérummal 60 percig blokkoltuk a fehérjék aspecifikus kötőhelyeit. A primer antitestek oldatát 2,5% kecskeszérumot tartalmazó PBS-sel hígítottuk (VIM (1:200), N-TUB (1:150), GFAP (1:3000), NFM (1:300)), és ezzel egy éjszakán át 4°C-on inkubáltuk a sejtkultúrákat. A PBS-sel történő mosást követően az Alexa fluor 488 fluoreszcens festékkel konjugált (anti-egér, illetve anti-nyúl IgG típusú) szekunder antitesteket szintén 2,5% kecskeszérumot tartalmazó PBS-sel hígítottuk, és ezekkel 60 percig szobahőn, sötétben inkubáltuk a fixált tenyészeteket. Desztillált vízzel történő mosást majd szárítást követően DAPI (4‘,6-diamidino-2-fenilindol) tartalmú Prolong Gold reagenssel (Molecular Probes) fedtük le a tárgylemezeket, majd sötétben, 4°C-on tároltuk a felvételek elkészüléséig. Kvantitatív polimeráz láncreakció A neurogén differenciáltatás végén a tenyészeteket 1% ß-merkapto-etanol tartalmú lízispufferrel lizáltuk, majd NucleoSpin RNA II kit (Macherey-Nagel) segítségével, DNáz-os emésztés alkalmazásával RNS-t izoláltunk. A kapott minták RNS-koncentrációját Nanodrop készüléken mértük. Az RNS tisztaságát 1%-os agaróz gélen történő elektroforézissel ellenőriztük, majd mintánként 500 ng RNS-ből High Capacity RNA to cDNA Master Mix (Applied Biosystems) felhasználásával végeztük a reverz transzkripciót. A valós idejű PCR vizsgálatokhoz TaqMan Universal Mastermix-et (Applied Biosystems) és az alábbi próbákat használtuk: Vimentin (Rn00579738_m1 ), nestin (Rn00564394_m1 ), N-TUB (Rn01431594_m1 ), NFM (Rn00566763_m1 ), NSE (Rn00595017_m1), belső kontrollként pedig az RPLP0-t (Rn00821065_g1) alkalmaztuk. Az amplifikáció során a ciklusok végén detektálható fluoreszcens jelet Step One Real-time System (Applied Biosystems) készülékkel mértük a következő beállítások mellett: DNS szintézis 50 °C 2 perc, denaturáció 95 °C 10 perc, majd 40 cikluson keresztül 95 °C 20 s és primer kötődése 60 °C 1 perc. A génexpressziós szintek változását a mintákban konstitutívan kifejeződő, belső kontrollként használt RPLP0 háztartási gén expressziós szintjére való normalizálással követtük nyomon. Eredmények Sejtizolálás és sejttenyésztés A patkány metszőfogak pulpájából származó sejtek izolálás után 24 órán belül letapadtak a tenyésztőedény műanyag felületére, majd elkezdtek osztódni. Egy hét múlva ezek a primer sejtkultúrák egy T25-ŐS tenyésztőflaskában elérték a konfluens állapotot. Az első néhány passzázs során (mindig szubkonfluens tenyészetet passzálva) a sejtek magas duplázódási rátát mutattak, azonban az osztódás sebessége az ötödik paszszázs után lecsökkent. A tenyészetben megváltozott a sejtek morfológiája is, míg kezdetben a sejtek többsége fibroblaszt-szerű morfológiát mutatott (3A. ábra), a későbbiekben a nagy felületen szétterülő, kerekded morfológia vált uralkodóvá. A további kísérleteinkhez emiatt alacsony passzázsszámú tenyészeteket használtunk. Elsőként arra voltunk kíváncsiak, hogy milyen szérumkoncentráció biztosítja a patkány DPSC-k esetében a legintenzívebb proliferációt, vagyis a differenciálatlan (progenitor) jelleg hogy marad fenn a legtovább. Megfigyeltük, hogy már 0,25% szérum hozzáadása is közel 30%-kal megnövelte a sejtszámot 24 óra alatt. Az 5, illetve 10%-os szérumkoncentráció pedig 60%-os sejtszámnövekedést okozott a szérummentes körülményekhez képest. Eredményeink alapján a patkány DPSC tenyészetek fenntartásához a legideálisabb az 5-10%-os szérumkoncentráció (1. ábra). 1. ábra: A szérum hatása a patkány DPSC-k életképességére. A WST-1 proliferációs reagens alkalmazásával mért abszorbancia érték arányos az életképes sejtek számával. Az eredményeket a szérummentes kontrollra vonatkoztattuk. Az értékek 8-8 független kísérlet átlagát mutatják, a hibasávok az átlag hibatartományát (SEM) jelzik.
