Fogorvosi szemle, 2013 (106. évfolyam, 1-4. szám)
2013-06-01 / 2. szám
55 FOGORVOSI SZEMLE ■ 106. évf. 2. sz. 2013. mást követő mérés után számoltuk ki. A mérési technikát akkor tartottuk megfelelőnek, ha a SEM érték kisebb volt, mint 0,5. Immunhisztokémiai vizsgálat A vitálmikroszkópos megfigyelések után az első csoport állatainak alsó metszők közötti fogínyszövetét immunhisztokémiai vizsgálat céljából kimetszettük. Az így nyert szövetdarabokat paraffinba ágyaztuk, majd ebből 12 pm vastagságú szeleteket készítettünk és ezeket tárgylemezre helyeztük. A metszeteket rehidráltuk és egy éjszakára szobahőmérsékleten nyúl eredetű VEGFR2 elleni antitesttel reagáltattuk (VEGF Receptor 2 (55B11) Rabbit mAb, Cell Signaling, Danvers, MA., hígítás: 1:20 0,01 M foszfát pufferolt fiziológiás sóoldat [PBS] segítségével). PBS-tal történő rövid öblítés után a metszeteket másodlagos, nyúl ellenes antiszérummal kezeltük (1:50, Immpress, Vector, Burlingame, CA.). Az immunreakciót a diaminobenzidine barna színű kicsapódása tette láthatóvá (DAB, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Kontrollnak a primer antitest vagy a szekunder antiszérum önmagában alkalmazva szolgált. Ezután a metszeteket hematoxylinnal megfestettük és fixáltuk (DePeX, Electron Mocroscopy Sciences, Fort Washington, PA.), majd lefényképeztük a fénymikroszkóphoz csatlakoztatott fényképezőgép segítségével (Olympus Vanox, Olympus, Tokyo, Japán). Statisztikai analízis Az adatok normalitását Shapiro-Wilk W teszttel ellenőriztük, a kiértékelésnél átlag ± SEM szerint számoltunk. További statisztikai vizsgálatot végeztünk kétutas (felhasznált vizsgálati anyag és a mérés időpontja) repeated measures analysis of variance (ANOVA) segítségével, majd Fisher féle least significant difference (Fisher LSD) post hoc tesztet alkalmaztunk. A szignifikancia szintet p<0,05-re állítottuk. A vizsgálatot statisztikai programcsomag segítségével végeztük (SAS/ STAT, software release 9.1.3., SAS institute, Cary, NC.). Eredmények lés kivédte a VEGF vazodilatációs hatását (4. csoport). (3. ábra) 1. ábra. Fogíny-venula átmérőjének változása a különböző VEGF koncentrációk függvényében (dózishatásgörbe). Az ábrán szemléltetésképpen a kísérleteinkben legszignifikánsabbnak bizonyult 5. perc értékeit ábrázoltuk a különböző koncentrációknak megfelelően. Referenciaként minden érték mellé felvettük az 5. perchez tartozó fiziológiás só értéket is (ezért ez egy konstans érték). A 10 és 50 pg/ml koncentrációk szignifikáns vazodilatációt okoztak a kontrolihoz képest (* p<0,05; átlag ± SEM, n=7 mindegyik koncentrációnál). 2. ábra. Venula érátmérőjének változása VEGF kezelés hatására a kiindulási érték százalékában, az idő függvényében. A VEGF oldatot az alsó metszőfogak közötti fogínyre cseppentettük. Mindkét koncentrációval szignifikáns vazodilatációt tapasztaltunk az applikálást követő 5. és 15. percben a kontroll fiziológiás sóoldathoz képest (*,§ p <0,05, a kontrolihoz képest; Fisher LSD; átlag ± SEM, n=7 mindegyik koncentrációnál). Egyik VEGF, illetve ZM323881 oldat sem változtatta meg szignifikánsan a szisztémás vérnyomást (kiindulás: 125/85 ± 8 mmFIg). Dózishatásgörbénk (1. ábra) felállítása során megállapítottuk, hogy a kontrollként használt fiziológiás sóoldat és a 0,1, valamint 1 pg/ml-es VEGF oldatok nem okoziak szignifikáns érátmérő változást a vizsgálat ideje alatt. A 10 és 50 pg/ml-es VEGF oldat viszont szignifikánsan dilatálta a gingivalis venulákat az alkalmazás utáni 5. és 15. percben (1. és 2. csoport). (2. ábra) ZM323881 önmagában történő alkalmazása sem okozott semmilyen szignifikáns érátmérő változást (3. csoport) a kontrollként használt fiziológiás sóoldathoz viszonyítva (1. csoport). (3. ábra) Másrészről viszont ZM323881-vel történő előkezeL-NAME-rel történő előkezelés szignifikánsan megnövelte a szisztémás vérnyomást (155/120 ± 12 mmHg), és csökkentette a venulák bazális átmérőjét a kontroll csoporthoz viszonyítva (L-NAME előkezelés: 35 ± 2 mm, kontroll csoport: 44 ± 2 mm). Az L-NAME előkezelés után használt vizsgálati anyagok nem változtatták meg a szisztémás vérnyomást. Az L-NAME előkezelés nemcsak kivédte a 10 pg/ml VEGF vazodilatációs hatását, de még vazokonstrikciót is okozott a kontrolihoz képest (5. csoport). (4. ábra) A gingivális arteriolák és venulák fala mérsékelt VEGFR2 specifikus immunpozitivitást mutatott. Immunreaktiv kicsapódást figyeltünk meg az endotélium területén, az érfal legbelső rétegében (5. ábra), ahol a sejtmagok általában az ér hossztengelyével párhu
