Hidrológiai Közlöny 2007 (87. évfolyam)
6. szám - XLVIII. Hidrobiológus Napok: Európai elvárások és a hazai hidrobiológia Tihany, 2006. október 4–6.
25 HIDROLÓGIAI KÖZLÖNY 2007. 87. ÉVF. 6. SZ. A szovátai Vörös-tó vizének tenyészthető aerob halofil baktériumközösségei Borsodi Andrea 1, Kiss Réka Ilona 2, Cech Gábor 1, Vajna Balázs 1, M. Tóth Erika 1, Máríaligeti Károly 1 "ELTE Mikrobiológiai Tanszék; 1117. Budapest, Pázmány Péter sétány 1/C. 2Babe§-Bolyai Tudományegyetem, Románia, 400006. Kolozsvár, Klinikák u. 5-7. Kivonat: A szovátai Vörös-tó az erdélyi Sóvidéki-medence sótartalmú kőzeteinek patakok általi kioldódása és alámosása révén létrejött heliotermikus sós tavak egyike, melynek NaCI koncentrációja elérheti a 20%-ot (w/v). E vizsgálat során a növekedésükhöz és szaporodásukhoz eltérő sókoncentrációkat igénylő halofil eubaktériumok kitenyésztését végeztük el a tóvizből különböző összetételű táptalajok felhasználásával. Az izolált törzseket sejtmorfológiai, fiziológiai és ökológiai tolerancia tulajdonságaik meghatározását követően 16S rDNS-ük parciális szekvencia analízisére alapozva faji szinten azonosítottuk. A törzseknek több mint fele Gram-negatív festődést mutató pálca volt, és mindössze 17 %-uk volt képes fakultatív anaerob növekedésre. Többségük 5-15 %-os NaCI optimummal mérsékelten halofil volt. A törzsek 37 %-át a Halomonas nemzetség (H. variabilis, H. taeanensis, H. salina, H. venusta, H. boliviensis) tagjaként azonosítottuk. A többi törzs a Marinobacter, Psychrobacter, Serratia, Morganella (y-Proteobaktériumok), a Bacillus, Exiguobacterium, Planococcus (kis G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumok), valamint az Arthrobacter, Micrococcus, Microbacterium, Nesterenkonia (nagy G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumok) nemzetségekbe tartozott. Kulcsszavak: Szováta, Vörös-tó, halofil baktériumok, 16S rDNS szekvencia analízis, faji diverzitás Bevezetés Szováta vagy más néven a Sóvidéki-dombság az Erdélyimedence keleti peremövezetében, a Kis-Küküllő felső folyása mentén helyezkedik el. A területre jellemző kősórétegek a miocén középső szakaszában alakultak ki a sekély beltenger elzáródása és az erőteljes párolgás következtében kicsapódó só felhalmozódása révén. Később a sórétegekre nehezedő egyre fokozódó nyomás azok törésvonalak menti elmozdulásához vezetett, ezáltal sótömzsök kerültek a felszínre. A felszíni és felszín alatti oldódási folyamatok változatos méretű és alakú sókarszt formákat hoztak létre. A Vörös-tó kialakulása is a sótartalmú kőzetek patakok általi kioldódását és alámosását követő víz felhalmozódás eredménye egy ilyen dolinában. A mintegy 70 m hosszú és 24 m széles, 1050 m 2-es vízfelszínnel rendelkező tó nevét a vizében nagy tömegben előforduló Artemia salina sórák vörös színéről kapta. A heliotermikus sós tó hőmérséklete 1,5 mes mélységben akár 52°C is lehet, NaCI koncentrációja elérheti a 20 %-ot (w/v) (Fekete és mtsai, 1998). A jelentős környezeti sókoncentrációkhoz és a szalinitásból eredő nagy ozmotikus nyomáshoz a prokarióták széles köre eltérő módokon alkalmazkodott. A mikroorganizmusok között a különböző NaCI koncentrációkhoz való viszonyulásuk (tűrőképességük, vagy igényük) alapján halotoleráns (sótűrő), vagy enyhén, mérsékelten, illetve kifejezetten halofil (sókedvelő), növekedésükhöz és szaporodásukhoz eltérő sókoncentrációkat (1-7 %, 7-15 %, illetve >15 % w/v NaCI) igénylő szervezeteket különíthetünk el (Zahran, 1997). A sós és szikes-sós élőhelyeket benépesítő extrém halofil mikroorganizmusok elsősorban archaeák, míg a mérsékelten halofil szervezetek között taxonómiailag változatos összetételű, aerob és fakultatív v. obligát anaerob eubaktériumok találhatók (Ventosa & mts, 1998; Oren, 2001, 2002). E munka során a Vörös-tó vizében élő, aerob halofil eubaktériumok kitenyésztését, fenotípusos jellemzését és 16S rDNS alapú filogenetikai meghatározását tűztük ki célul. Vizsgálati anyag és módszerek A Vörös-tó vizéből a felszíntől kb. 10 cm-es mélységből 2003. október 5-én gyűjtöttünk mintát. A hűtve tárolt vízmintákból hígítási sorozatot készítettünk, és annak különböző tagjaiból tengervizes (T) DSMZ Medium 246 ( www. dsmz.d e ), oligotróf (O) (pepton 12 g, MgS0 4 0,2 g, CaCl 2 x 2H 20 0,15 g, agar 18 g, desztillált víz 1000 ml, pH 7,0), valamint egy általunk módosított oligotróf (OM) (pepton 1,5 g, élesztőkivonat 1 g, CH 3NH 2 1 g, mesterséges tengervíz 500 ml, desztillált víz 500 ml, pH 7,0) táptalajra szélesztettünk. Az 1 hetes inkubációt követően fejlődött eltérő telepmorfológiai tulajdonságokat mutató, különálló telepeket a lemezekkel azonos összetételű ferde tápagarra izoláltuk. A baktériumtörzsek fenotípusos tulajdonságai közül (/. táblázat) vizsgáltuk a Gram-festődést (1), a sejtmorfológiai sajátosságokat, a mozgásképességet (2), a kataláz (3) és oxidáz (4) reakciót, a D-glükóz oxidatív (5, 7) és fermentatív (6, 8) értékesítését 24 h és 1 hét után, a metilvörös (9) és Voges-Proskauer (10) reakciót, a nitrát redukciót nitritig (11), az ammonifikációt (12), a kénhidrogén (13) és indolképzést (14), valamint a NaCI toleranciát 0 és 30% között (Smibert és Krieg, 1994). A 16S rDNS szekvencia analízisére alapozott faji szintű azonosításhoz a törzsek genomiális DNS-ét V-gene kit segítségével nyertük ki. Ezt követően a 16S rDNS fragmentumokat 27f és 1492r univerzális eubakteriális primer pár felhasználásával szelektíven felszaporítottuk, majd a PCR termékeket Viogene Clean Up System kit segítségével megtisztítottuk. Az izolált és a felszaporított DNS jelenlétét UV fény alatt 1 %-os agaróz gélben detektáltuk. A PCR termékek szekvenálását 519r primer felhasználásával a jelölt terminátorú ciklikus szekvenálás módszerével végeztük, a kapott szekvenciák filogenetikai hovatartozását a BLAST internetes adatbázis segítségével ellenőriztük. Eredmények és értékelésük A Vörös-tó vizéből a T táptalajról 30, az O táptalajról 27, az OM táptalajról 23 törzset izoláltunk, melyek közül összesen 35 törzset (16 T, 13 O, 6 OM) sikerült fenntartani a laboratóriumi vizsgálatok végéig. Az elvégzett fenotípusos vizsgálatok alapján a kataláz tesztben valamennyi törzs pozitívnak bizonyult. 60%-uk Gram-negatív festődésű volt, 30 %-uk coccoidális, 70 %-uk különféle pálca sejtmorfológiát mutatott, és 30%-uknál a függőcsepp preparátumokban aktív csillómozgást lehetett megfigyelni. A törzsek legnagyobb részét (86 %-át) aerob oxidatív anyagcsere jellemezte, és az anaerob növekedésre utaló különféle fermentációs (6, 8, 9, 10), valamint a nitrát-redukciós (11) tesztekben mindössze 14-17%-uk adott pozitív eredményt (1. táblázat). A törzsek közel 500 bázispár hosszúságú 16S rDNS-ének filogenetikai analízise meglepően nagy faji diverzitást eredményezett. 21 baktériumtörzs a y-proteobaktériumok Halomonas, Marinobacter, Psychrobacter, Serratia, Morganella, 7 törzs a Firmicutes kis G+C tartalmú Gram-pozitívok Planococcus, Bacillus, Exiguobacterium, és ugyancsak 7 törzs az Actinobacteria nagy G+C tartalmú Gram-pozitívok Micrococcus, Arthrobacter, Microbacterium, Nesterenkonia nemzetségeibe nyert besorolást. A vizsgált törzseket 95-100 %-os szekvencia hasonlósággal összesen 21 különböző fajhoz tartozónak határoztuk meg. Az oligotróf és a tengervizes táptalajokról kitenyésztett törzsek 11 illetve 9, a módosított oligotróf táptalajról származó törzsek azonban csak 3 különböző baktériumfaj reprezentánsai voltak (1. táblázat).
