Horváth László (szerk.): Halbiológia és haltenyésztés (Mezőgazda Kiadó, Budapest, 2000)
1. Biológiai alapismeretek - 1.4 Orbán László: Molekuláris eljárások alkalmazása a haltenyésztésben
enzim teszi lehetővé. A reakció alaptípusát ismert DNS szakasz „felszaporítására” alkalmazzuk, itt tehát a másolás megkezdéséhez szükséges „oligonukleotid primerek” a mintául szolgáló ún. templát két szálára feltapadva közrefogják a megsokszorozandó régiót (27, ábra). A reakció három lépés ciklikusan ismétlődő sorozatából áll. Az első lépés a dcnaturálás, azaz a DNS spirál két szálának szétválasztása, ez általában 92-95 °C-on zajlik le, melyet a hőstabil enzim igen jó tolerál. Utána a reakcióelegyet olyan hőmérsékletre (általában 50-70 °C) hűtjük le, amely lehetővé teszi a „primerek” specifikus feltapadását (annealing) a DNS azon „komplementer” szakaszaira, melyeknek a bázissorrendje éppen ellentétes a primerével. A folyamat harmadik lépése a lánchosszabbítás (elongation), amelyben a feltapadt primerekről kiindulva a Taq DNS polimeráz lemásolja a DNS-t 72 °C-on. Ezután kezdődik a második ciklus ismét a denaturálással, azonban ekkor már elvileg kétszer annyi DNS mintáról folytatódhat a másolás, hiszen az előző ciklusban szintetizálódott egyszálú DNS a következő ciklusban a másik szál szintéziséhez szolgál kiindulási alapul, azaz templátként. Harminc ciklus (a paraméterektől függően 3-4 óra) elteltével a kiválasztott DNS szakasz mennyisége elvileg 230-szorosára, azaz százmilliószorosára6 (!!) növekedhet meg. Némileg erőltetett analógiával a PCR reakció egy olyan automata másológépnek tekinthető, amely képes arra, hogy tíz átlagos méretű családi könyvtárnyi szövegből kezdő és befejező szavak alapján kijelöljön egy fejezetet, majd néhány óra leforgása alatt, a másolatokat is másolva több millió kópiát állítson elő. Ahhoz azonban, hogy ez a másolás megfelelő pontossággal és hatékonysággal működhessen a több, mint tucatnyi komponenst tartalmazó, meglehetősen bonyolult reakció körülményeit előtte optimalizálni kell. A polimeráz láncreakció új horizontokat nyitott meg az élő szervezetek örökítő anyagát, a genomot vizsgáló kutatások előtt, 3-4 nagyságrenddel lecsökkentette a vizsgálathoz szükséges mintamennyiséget7. Az alapreakciónak mára ezernyi változata született, nem csak ismert, hanem ismeretlen DNS szakaszok felsokszorozását is elvégezhetjük ezzel a módszerrel. 1.4.2.7. Génkönyvtárak A génkönyvtár olyan baktériumsejtek gyűjteménye, melyek mindegyike néhány tízezer bázispámyi méretű idegen genomdarabot tartalmazó, önálló szaporodásra képes DNS-vektort hordoz magában. Egy ilyen könyvtár reprezentálja egy adott egyed illetve egyedcsoport genomját (genomikus könyvtár), vagy expresszált hírvivő RNS-ből DNS-sé visszafordított szekvenciáit (cDNS könyvtár). Ezekből a speciális DNS-gyűj- teményekből egy adott szekvencia - a környezetébe tartozó, hozzá kapcsolódó DNS szakaszokkal együtt - a megfelelő jelölt próbát „molekuláris horogként” alkalmazva izolálható. így a génkönyvtár egy adott faj (egyed) genomjának olyan archivált formája, melyből egy adott tulajdonságot hordozó gén viszonylag könnyen azonosítható. 6 A gyakorlatban a templátként szolgáló DNS szakasz általában „mindössze” néhány tíz, esetleg százezerszeresére sokszorozódik. 7 Míg a DNS ujjlenyomat elkészítéséhez általában 5-10 mikrogrammnyi DNS mintára van szükség, addig a PCR anyagigénye ennek a mennyiségnek (tíz)ezredére, azaz néhány nanogrammnyi- ra tehető. 149
