Szemészet, 2010 (147. évfolyam, 1-4. szám)
2010-05-01 / 1. szám
Szemészet 1. táblázat. A vizsgálatban szereplő graftrejekciót mutató betegek klinikai adatai Beteg Kor (év) Nem Első PKP oka Vizsgált PKP sorszáma** RePKP-ig eltelt idő 1. 39 Nő Keratitis herpetica 2. 2 év 2. 49 Férfi Ulcus corneae 1. 4 hét 3. 20 Férfi Maródás 3. 1 év 4. 58 Férfi Keratitis herpetica 3. 10 hét 5. 68 Nő Ulcus corneae 2. 16 hét 6. 46 Férfi Sérülés 1. 2 év 7. 29 Férfi Maródás 2. 2 év 8.* * Férfi 9 * Férfi 10.* Nő PKP: perforáló keratoplasztika; RePKP: perforáló rekeratoplasztika *3 esetben nem állt anamnesztikus adat rendelkezésre **a sorszám jelentése: a vizsgált corneadarab hányadik PKP-ból származik Vizsgálatunk célja az allografttal szembeni immunválasz kialakításában szerepet játszó egyes gyulladásos sejtek tipizálása volt, így a CD3- (T-sejt), CD8- (citotoxikus T-sejt), CD163- (macrophag), CDllc- (dendtiticus sejt, macrophag) és CD79a- (В-sejt) expresszió meghatározása graftrejekciót mutató corneákban. Betegek és módszer A vizsgálatban szereplő CD-markerek expresszióját 10 graftrejekciót mutató (életkor 44±16 év), valamint 6 kontrollként szolgáló normál humán cornea (életkor 56± 16 év) esetében határoztuk meg. A graftrejekciót mutató corneákat szövettani vizsgálattal választottuk ki perforáló keratoplasztika alkalmával eltávolított corneadarabokból, hematoxilin-eozin festést alkalmazva. A graftrejekció kritériumai között szerepelt a cornea ereződése, gyulladásos sejtek beszűrődése, az oedema és klinikailag a corneahomály megjelenése. A vizsgált betegcsoport a Semmelweis Egyetem I. Szemészeti Klinikáján perforáló keratoplasztika műtéten esett át. A cornealis graftrejekciót mutató betegek klinikai adatai az 1. táblázatban láthatók. A kontroll normál humán corneák melanoma malignum miatt enukleált bulbusokból származó szaruhártyák voltak. A CD-markereket immunhisztokémiai módszerrel, monoklonális antitestek segítségével azonosítottuk. A vizsgálatban szereplő elsődleges ellenanyagok részletezését a 2. táblázat tartalmazza. A formaiinban fixált, paraffinba ágyazott szövetekből 5 pm vastagságú metszetek 2. táblázat. Az immunhisztokémiai eljárás során használt elsődleges ellenanyagok adatai Antitest Klón Izotípus Forrás Hígítás CD3 SP7 Nyúl-IgG Láb Vision 1/400 CD8 SP16 Nyúl-IgG Láb Vision 1/150 CDllc 5D11 Egér-IgG2a Novocastra 1/200 CD 163 10D6 Egér-IgGl Láb Vision 1/400 CD79a JCB117 Egér-IgGl, kappa DakoCytomation 1/50 készültek. A deparaffinálást követően az endogén peroxidázaktivitás gátlását végeztük, a mintákat 0,5% hidrogén-peroxid-tartalmú metanolban 20 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk. Az antigénfeltárás során a metszeteket 50 percen keresztül mikrohullámú sütőben Tris-EDTA pufferben melegítettük. Ezt követően az aspecifikus kötőhelyek gátlására Novolink Protein Block-ot (Novocastra Laboratories Ltd., Newcastle, Egyesült Királyság) alkalmaztunk 10 percig. A metszeteket specifikus anti-humán monoklonális ellenanyagokkal inkubáltuk egy éjszakán át szobahőmérsékleten. A negatív festési kontrollok ez idő alatt TBS pufferben inkubálódtak. A mosási lépést követően a Novolink Post Primary Blockot (Novocastra) alkalmaztuk szobahőmérsékleten 30 percen keresztül, hogy elősegítsünk a másodlagos ellenanyag szövetbe való bejutását, majd a tormaperoxidázzal konjugált másodlagos anti-egér/ nyúl ellenanyaggal (Novolink Polymer, Novocastra) inkubáltuk 30 percig szobahőmérsékleten a metszeteket. Ezt követően a reakciót a kromogén szubsztrát (DAB, Novocastra) hozzáadásával tettük láthatóvá, végül hematoxilinnel kontrasztfestést végeztünk. A mintákat fénymikroszkóppal vizsgáltuk (Olympus CH-2, model CHT, Japán). Mivel a rejekciós reakciót mutató szaruhártyák többségében az epithelium hiányos volt, a CD-markerre pozitív sejtek számát az epitheliumban statisztikailag a normál cornealis epitheliumban fellelhető CD-markerre pozitív sejtek számával nem vetettük össze, csupán leírást adtunk azok elhelyezkedéséről. A teljes stromára vonatkozó adatok kiértékelése mellett a stromában igazolható pozitív festődésű sejtek elhelyezkedésének meghatározása érdekében a cornealis stromát minden esetben átmérője mentén 3 egyenlő részre osztottuk, 1 centrális és 2 perifériás részre. A centrális stromát további 3 részre tagoltuk, az elülső, a középső és a hátsó stromára. A megfestett mintákat digitális mikroszkóp segítségével is lehetőségünk volt vizsgálni (Miraxscan, 3DHistech, Budapest, Magyarország). A Histoquant képanalizáló szoftver használatával a teljes stroma 3 reprezentatív részén az 1 mm2 területre eső pozitív sejteket megszámoltuk, és az átlagokat összehasonlítottuk a 2 vizsgált csoportban. A centrális stroma fent említett 3 részében (elülső, középső és hátsó stroma) szintén az 1 mm2 területre eső CD-markerre pozitív sejtek számát átlagoltuk. Ezt követően a centrális stroma három részére vonatkozólag szintén összehasonlítottuk a rejekciós reakciót mutató és a kontroll mintákban kapott értékeket. Stündl Adrienn
