Szemészet, 2003 (140. évfolyam, 1-4. szám)
2003-06-01 / 2. szám
Szemészet 1. táblázat. Betegeink nem és kor szerinti megoszlása Nem (nő/férfi) Kor (év) Kontroll 3/4 70,20+5,35 Diabeteses Nem-diabeteses 5/3 70,25+6,93- progrediens 7/3 75,10+9,83- matur 2/2 75,50+13,08 Cataracta (ossz) 14/8 73,40+9,37 kutatások érdeklődésének előterében áll. Szövetkultúrából származó, valamint állatkísérletes és humán műtéti minták biokémiai analízisével alapkutatás és alkalmazott kutatás szinten egyaránt foglalkoznak a cataracta etiopatogenezisének felderítésére, különös tekintettel a fehérjékre. Az újabb vizsgálómódszerek lehetőséget nyitnak nemcsak fehérje-térképezésre” (pl. gélelektroforetikus kétdimenziós, ún. proteom analízisekre), hanem immunkémiai fehérjeazonosításra is. A cataracta patogenezisében igazoltan alapvető szerepet játszó poszt-transzlációs fehérjemódosulások vizsgálatát is az újabb módszertani fejlesztések tették lehetővé. Közleményünkben a cataractás lencsére irányuló szisztémás vizsgálataink kezdeti eredményeit mutatjuk be. Jóllehet kutatási irányunk távlati fő célja a másodlagos szürke hályog patogenezisében szerepet játszó fehérjék közelebbi megismerése, érdeklődésünk kiterjedt a kóros és normális lencse fehérje-összetételére is. Ezen összehasonlító vizsgálatok révén értékes saját kísérleti adatokat nyertünk, melyeket további kutatásainkhoz hasznosíthatunk. Közleményünkben egyrészt ismertetjük a cataractás lencsék szolúbilis/inszolúbilis fehérjefrakcióinak gélelektroforetikus vizsgálatait, másrészt bemutatjuk a poszt-transzlációs módosulások közül az oxidativ stressz okozta változásokat igazoló, HPLC-technikával nyert adatainkat, melyekkel a fenilalanin oxidativ módosulása révén képződő aminosavakat sikerült kimutatnunk. Anyag és módszerek A vizsgált minták Phacoemulsificatiós technikával végzett extracapsularis cataractaműtétek során eltávolított humán lencséket vizsgáltunk. A mintákat a lencsehomály mértékétől függően (progrediens és matur), valamint a diabeteses anyagcserezavar megléte, illetve hiánya szerint osztályoztuk. A műtéteket cseppel (Humacain=oxybuprocainium chloratum) végzett érzéstelenítés és pupillatágítás (Phenylephrin 10%=phenylephrinum hydrohlorid, Mydrum=tropicamid) után 3,2 mm hosszú, ún. clear cornea seben keresztül végeztük. Viszkoelasztikus anyag alatt csipesszel capsulorhexist készítetünk, amit hydrodissectio és a lencsemag forgatása követett. A magot „divide and conquer” phacoemulsificatiós technikával távolítottuk el, a kérget irrigáció-aspirációval. Szükség esetén a hátsó tokot políroztuk, illetve „porszívóztuk”, majd viszkoelasztikus anyag mellett, 4,1 mm-re történő sebnagyobbítás után összehajtható műlencsét ültettünk a tokzsákba. A viszkoelasztikus anyag alapos kimosása után a kötőhártya alá adott Gentamicin (gentamicin) és Oradexon (dexamethason) injekcióval fejeztük be a műtétet. 2. táblázat. Lencsefehérjék megoszlása a szolúbilis és inszolúbilis frakciókban n mg protein/ g nedvessúly Inszolúbilis protein (%) Szolúbilis protein (%) Kontroll 14 233,94+88,40 25,24+7,38 74,76+7,38* Diabeteses 8 52,72+9,66 47,28+9,66 Nem-diabeteses - progrediens 10 65,25+15,65 34,75+15,65- matur 4 58,92+16,41 41,08+16,41 Cataracta (ossz) 22 59,55+14,42 40,45+14,42* *p<0,001 (Student-féle kétmintás t-próba) Kontrollként szaruhártya-átültetés céljából enukleált cadaverszemek tiszta szemlencséi álltak rendelkezésünkre. A cadaverlencsék a bulbusból való eltávolítást követően 2-2 ml feltáró pufferben (1. alább) kerültek szállításra. A további feldolgozásuk késedelem nélkül történt. Közvetlenül a műtétet követően a betegminták visszanyerése a műtéti aspirátumból (BSS, hialuronsav-tartalmú médiumból) történt: 13000 rpm-el, 30 percig centrifugálva (Sorvall RC-5/Du Pont). Az így nyert pelletet pufferolt (150 mM TRIS HC1, pH 6,8), 1 mM EDTA, 4 mM EGTA és 0,2 mM PMSF tartalmú feltáró oldatban vettük fel. Ezt követően mind a kontroll-, mind a betegmintákat azonosan kezelve homogenizáltuk 5 percig, üveg-teflon potterezéssel. A további feldolgozásig a homogenizátumokat -70 °C-on tároltuk. Felolvasztás után, újabb homogenizálást követően aliquot mintákból fehérje-meghatározást (totál protein) végeztünk Bradford szerint. A szolúbilis fehérjefrakciókat mintánként az össz-homogenizátumok aliquot mennyiségeinek centrifugálásával nyertük (13000 rpm, 30 perc, Eppendorf), szupernatánsként. Ezek fehérjekoncentrációit szintén meghatároztuk. A szolúbilis fehérjék részarányát az összfehérje százalékában fejeztük ki. A lencsefehérjék nedvessúlyra vonatkoztatott mennyiségét csak a cadaverminták esetében volt módunkban vizsgálni. Gélelektroforetikus vizsgálat A fehérjék szeparálása egydimenziós SDS poliakrilamidlapgél elektroforézissel történt, Laemmli szerint.16 Mind a teljes homogenizátumokból, mind a szolúbilis, szupernatánsként nyert fehérjékből összehasonlító elektroforéziseket végeztünk. A mintákhoz Laemmli-féle mintapuffert adtunk (2% SDS, 2% ß-merkaptoetanol, 10% glicerin, I mM EDTA, 4 mM EGTA, 150 mM TRIS HC1, pH 6,8). A mintapuffer-hígításokból pásztánként 3-3 pg proteint analizáltunk, 12,5%-os gélben, Mini Protean 3 (BioRad) cellában. Markerként kis molekulasúlyú (Sigma LMW) fehérjéket futtattunk (94, 67, 43, 30, 20,1, 14,4 kDa). A fehérjefrakciók detektálása hagyományos CBB R-250 festést követően, ezüstös intenzifikálással, Willoughby21 szerint történt. Az elektroforetogramok fotódokumentációját követően a „festett” géleket direkt denzitometrálással értékeltük (Beckmann denzitométer, 420 nm). Bíró Zsolt
